核酸堿基薄層層析及雙波色譜掃描分析準(zhǔn)確度驗(yàn)證
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薄層層析（TLC）技術(shù)
核酸組成成分及衍生物的分析除常用的電泳、紙層析和薄層層析 洗脫比色法外，近年來又出現(xiàn)了雙波長色譜掃描法和高壓液相層析法。但已報(bào)道的雙波長色譜掃描法測定的堿基種類不多，在測定DNA (G + C)克分子外方面，尚未見報(bào)道。我們在實(shí)驗(yàn)中摸索出分離核酸堿基效果好的硅膠薄層析，并考查了雙波長色譜掃描分析法的準(zhǔn)確度。
材料和方法
(一)主要試劑及儀器
1.試劑堿基A, G, C, T 和U，均為層析純，含量>98多;A, U德國產(chǎn)，C為BDH產(chǎn)，G, T分別為上海東海制藥廠和恒信化工廠產(chǎn)。小牛胸腺DNA為上海牛奶公司產(chǎn)。薄層層析用硅膠H,為青島海洋化工廠產(chǎn)。薄層層
析用纖維素(Cell ulo sepulverM N300UV254)，德國產(chǎn)。狡甲基纖維素鈉為上海化學(xué)試劑廠產(chǎn)。
其他試劑為AR，水為重蒸水。
2.儀器日本島律CS-910雙波長色譜掃描儀。
(二)分析方法
1.薄層層析分離 (1)制板： 取16.28硅膠H, 1.8 g MN30OUV 254纖維素，0.5外挾甲基纖維素鈉(離心去除懸浮物)90ml，于勻漿器中勻漿5分鐘，速度以漿液不濺出為度，抽氣，均勻涂布在6塊20× l 0 cm或4塊20×1 5cm的平整清潔的玻板上。
(2)薄層分離：稱取25X103nM (1nM二10-9 M)A ,G ,C ,T ,U ,盛于不同容器中，再分別稱取同樣量的上述各堿基混合于一個(gè)容器，各加Im l水，1滴12N NaOH 液助溶，后加1滴濃HCl，用0.1 N HCI稀釋到5m1。將上述硅膠薄層板于105℃活化半小時(shí)，按常法把單個(gè)及混合的堿基溶液分別點(diǎn)在不同的點(diǎn)上，用飽和正丁醇上行展開至前沿12cm 處取出，時(shí)間1.5小時(shí)。層析后風(fēng)千或吹干，于254nm紫外燈上定位，畫出各堿基斑點(diǎn)的位置，計(jì)算
Rf值。
2. DNA 堿基定量分析
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取并按上法配成各種堿基濃度為5nM/μl的A, G, C, T標(biāo)準(zhǔn)堿基混合液，取活化的3塊20× 10cm硅膠板，每板點(diǎn)5點(diǎn)，分別為1,2,3,4,5岡，按前層析，用CS-910雙波長色譜掃描儀測定。測定條件：λS=265nm, λR=370nm，反射法，線性掃描。用量高法計(jì)積分值，將各板中種類和含量均相同的堿基之積分值加和平均，求各堿基積分值和nM 之間關(guān)系的回歸方程，作出以積分值(任意單位)為Y, nM 為X的回歸直線，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)樣品測定：加2 mg DNA樣品和2m188多甲酸于GG 17玻璃制的2m1安瓶中，按Aaron Bendicht4，法水解，依標(biāo)準(zhǔn)堿基溶液配法溶成0.2m1樣品液。取不同量的樣品液與3μl標(biāo)準(zhǔn)堿基混合液點(diǎn)于同板的不同點(diǎn)上，層析和掃描測定后，選取積分值與標(biāo)品積分值相差不大的樣品量作為測定點(diǎn)樣量。取3塊薄層板，每板點(diǎn)標(biāo)品3μl，共3點(diǎn)，樣品按預(yù)測量點(diǎn)樣，亦為3點(diǎn)，照前層析和掃描，分別求出各板中標(biāo)品和樣品相應(yīng)堿基積分值的平均值，在相應(yīng)堿基標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出標(biāo)品積分值和15nM 所在的點(diǎn)，從該點(diǎn)推出標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行線，即校正曲線，其上由樣品積分值對應(yīng)的X值就是樣品的nM數(shù)。如果樣品和標(biāo)品積分值接近，也可由樣品rim二樣品積分值X15"標(biāo)品積分值，直接算出來。
就得到分析結(jié)果。把3塊薄層板測得的上述數(shù)值平均，便是該DNA的堿基組成。
結(jié)果和討論
(一)堿甚菠層層析結(jié)果
如表1和圖1示。對于核酸堿基薄層層析分離，大多數(shù)文獻(xiàn)是使用纖維素板，據(jù)我們多方實(shí)驗(yàn)不如硅膠板層析好。聚酸胺薄層析[113可以把RNA堿基A, G, C, U分開(G在原點(diǎn))，但未報(bào)道DNA堿基中的T層析數(shù)據(jù)。檜山千都子等[[z]的硅膠薄層層析分離的堿基種類也很少。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，摸索出的硅膠薄層層析法，只經(jīng)單向展層就徹底分開了A, G, C, T, U 5種堿基混合物，各斑點(diǎn)很明晰，效果穩(wěn)定，重現(xiàn)性很好，既可用于DNA及RNA堿基分離，又可用于此兩種核酸混合物的各堿基測定。在薄層板的兩端可各作一次分析，省時(shí)省原料。
(二)定量分析
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2示。回歸方程的‘檢驗(yàn)：查t表，df=n-2=3, t 0.01=5.841，而現(xiàn)在A的t=33.43, G為17.96, C為17.39,T為9.26，均>10.01，故P<0.01，差異極為顯著。這表明5-25nM范圍內(nèi)線性關(guān)系好，宜作定量分析，靈敏度也高，可測小于l,ug的堿基。由于有明顯的線性關(guān)系，所以在此范圍內(nèi)如果樣品和標(biāo)品積分值接近，可由樣品nM二樣品積分值X15/標(biāo)品積分值，直接算出樣品堿基含量，省去作標(biāo)準(zhǔn)曲線，使工作更為簡便。
2.分析結(jié)果如表2示。由表2數(shù)據(jù)可看出，(G+C)克分子外最大標(biāo)準(zhǔn)誤差在1 0.66以下，相對誤差土1.28%以下，各堿基的最大標(biāo)準(zhǔn)誤差在1 0.50以下，相對誤差4.42務(wù)以下，符合一般光學(xué)分析法的誤差范圍。另外，將本實(shí)驗(yàn)測得的小牛胸腺DNA(G+C)克分子%，44.02多，與文獻(xiàn)[[31報(bào)道的不同作者的常法分析結(jié)果為41.60-44.80并相比，也說明本法結(jié)果可靠。
本報(bào)告摸索出的核酸堿基硅膠薄層層析雙波長色譜掃描分析，只需1.5小時(shí)的單向?qū)与x就可把A, G, C, T, U徹底分開，掃描測定半小時(shí)即可完成，可測低至5nM (即1ug 以下)的堿基，經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理完全符合一般光學(xué)分析法的準(zhǔn)確度(相對誤差士5多);溶劑系統(tǒng)簡單，主要用國產(chǎn)硅膠，故價(jià)廉。所以，在核酸堿基分析方面，與現(xiàn)在常用的紙層析和薄層層析洗脫比色法比較，本法簡便、快速、靈敏、可靠。
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