地高辛標記寡核苷酸探針

1．組織處理

　　（1）冷凍切片：厚10～20μm，貼于事先經清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃，在應用于雜交實驗前，使迅速回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。
　　（2）石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min ×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每個濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
　　（3）離心細胞涂片：將細胞先以4%多聚甲醛固定，應用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應用PBS（含5mmol/l MgCl2）5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。

　　2．探針準備35pmol的寡核苷酸（oligo -）探針，3’ 終末標記以地高辛-11–dUTP。

　　3．預雜交和雜交加約300μl預雜交液（配制法見附錄）在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA，在應用前須在沸水浴中加熱10min，而對酵母tRNA可不用加熱變性。
　　（1）應用預雜交液稀釋地高辛標記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據于待測核苷酸含量和實踐的結果。如對于檢測大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。
　　（2）預雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周圍水份，加30μl雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37℃過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫），0.5×SSc 37℃洗半小時，0.5×SSC室溫漂洗半小時。

　　4．地高辛顯示。

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