免疫熒光技術(shù)
基本原理
將熒光素標記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。
試劑與 儀器
磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
熒光標記的抗體溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進行稀釋
緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
搪瓷桶三只(內(nèi)有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊)
熒光顯微鏡
玻片架
濾紙
37℃溫箱等。
實驗步驟
1. 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待檢標本片上,10min后棄去,使標本保持一定濕度。
2. 滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,使其完全覆蓋標本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一定時間(參考:30min)。
3. 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不時振蕩。
4. 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。
5. 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標本的特異性熒光強度,一般可用“+”表示:
(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++ --++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,而各種對照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。
注意事項
1. 對熒光標記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。
2. 染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化,染色時間可以從10 min到數(shù)小時,一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強染色效果,但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。
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