逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR
逆轉錄- 聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，RT-PCR) 的原理是：提取組織或細胞中的總RNA ，以其中的mRNA 作為模板，采用Oligo （dT ）或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA 。再以cDNA 為模板進行PCR 擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR 使RNA 檢測的靈敏性提高了幾個數量級，使一些極為微量RNA 樣品分析成為可能。該技術主要用于：分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA 探針、構建RNA 高效轉錄系統。
一、反轉錄酶的選擇
1 ． Money 鼠白血病病毒（MMLV ）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA 酶H 活性相對較弱。最適作用溫度為37 ℃ 。
2 ． 禽成髓細胞瘤病毒（AMV ）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA 酶H 活性。最適作用溫度為42 ℃ 。
3 ．Thermus thermophilus 、Thermus flavus 等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶：在Mn2 存在下，允許高溫反轉錄RNA ，以消除RNA 模板的二級結構。
4 ．MMLV 反轉錄酶的RNase H- 突變體：商品名為SuperScript 和SuperScript Ⅱ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA 轉換成cDNA ，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA 模板合成較長cDNA 。
二、合成cDNA 引物的選擇
1 ． 隨機六聚體引物：當特定mRNA 由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA 。用此種方法時，體系中所有RNA 分子全部充當了cDNA 第一鏈模板，PCR 引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA 中96% 來源于rRNA 。
2 ． Oligo(dT) ：是一種對mRNA 特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA 具有3 ’ 端Poly(A ) 尾，此引物與其配對，僅mRNA 可被轉錄。由于Poly(A )RNA 僅占總RNA 的1-4% ，故此種引物合成的cDNA 比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA 在數量和復雜性方面均要小。
3 ． 特異性引物：最特異的引發方法是用含目標RNA 的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR 反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’ 端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA ，導致更為特異的PCR 擴增。
二、 試劑準備
1 ．RMA 提取試劑
2 ．第一鏈cDNA 合成試劑盒
3 ．dNTPmix ：含dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 各2mM
4 ．Taq DNA 聚合酶
三、操作步驟
1. 總RNA 的提取：見相關內容。
2. cDNA 第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA 第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一。現以GIBICOL 公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
（1 ）在0.5ml 微量離心管中，加入總RNA 1-5 μg ，補充適量的DEPC H2 O 使總體積達11 μl 。在管中加10 μM Oligo （dT ）12-18 1 μl ，輕輕混勻、離心。
（2 ）70 ℃ 加熱10min ，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min 。
然后加入下列試劑的混合物：
10 × PCR buffer 2 μ l
25mM MgCl2 2 μ l
10mM dNTPmix 1 μ l
0.1M DTT 2 μ l
輕輕混勻，離心。42 ℃ 孵育2-5min 。
（3 ）加入Superscript Ⅱ1 μl ，在42 ℃ 水浴中孵育50min 。
（4 ）于70 ℃ 加熱15min 以終止反應。
（5 ）將管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37 ℃ 孵育20min ，降解殘留的RNA 。-20 ℃ 保存備用。
3 ．PCR ：
（1 ）取0.5ml PCR 管，依次加入下列試劑：
第一鏈cDNA 2 μ l
上游引物（10pM ） 2 μ l
下游引物（10pM ） 2 μ l
dNTP(2mM ) 4 μ l
10 × PCR buffer 5 μ l
Taq 酶（2u/ μl ） 1 μ l
（２） 加入適量的ddH2 O ，使總體積達50 μl 。輕輕混勻，離心。
（３） 設定PCR 程序。在適當的溫度參數下擴增28-32 個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR 擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD ）的特異性引物，同時擴增內參DNA ，作為對照。
（４） 電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。
（５） 密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。
四、注意事項
1 ． 在實驗過程中要防止RNA 的降解，保持RNA 的完整性。在總RNA 的提取過程中，注意避免mRNA 的斷裂。
2 ． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。
3 ． 內參的設定：主要為了用于靶RNA 的定量。常用的內參有G3PD （甘油醛-3- 磷酸脫氫酶）、β-Actin （β- 肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA 定量誤差、加樣誤差以及各PCR 反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
4 ． PCR 不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA 起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環數，均應通過單獨實驗來確定。
5 ． 防止DNA 的污染：
（１） 采用DNA 酶處理RNA 樣品。
（２） 在可能的情況下，將PCR 引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA 的共線性
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