沙眼衣原體診斷研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞： 沙眼衣原體 診斷

　　 摘要 沙眼衣原體感染在人群中很普遍，但臨床上并未引起重視，本文綜述了近年來(lái)診斷沙眼衣原體感染的進(jìn)展，著重介紹了分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)沙眼衣原體中的應(yīng)用，并提出了診斷沙眼衣原體的新的擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)。

　　沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis,CT）感染是發(fā)展中國(guó)家可預(yù)防的致盲的最重要的原因，也是西方工業(yè)化國(guó)家最常見的性病。CT可引起泌尿生殖道感染，胎兒感染CT可致新生兒結(jié)膜炎、新生兒和小嬰兒肺炎，以及其他并發(fā)癥如獲得性反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Retier's綜合征[1]。由于CT感染臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，所以常易漏診。近年來(lái)在確診CT感染方面進(jìn)展迅速，本文將其綜述如下。

　　CT的形態(tài)學(xué)檢查

　　最初診斷CT感染的實(shí)驗(yàn)是吉姆薩（Giemsa）染色。這種方法在CT被分離出來(lái)前50年就開始應(yīng)用，通過(guò)證實(shí)被感染細(xì)胞內(nèi)CT包涵體的存在而判斷是否感染CT。但是由于其敏感性和標(biāo)本收集上有困難，未能成為一種常規(guī)檢測(cè)方法。此種涂片染色的標(biāo)本要求必須有大量的（數(shù)以千計(jì)）上皮細(xì)胞，而鏡檢也較費(fèi)時(shí)，同時(shí)也受觀測(cè)者的主觀影響。在診斷男性尿路感染時(shí)敏感性較低，其陽(yáng)性率僅為培養(yǎng)證實(shí)CT感染的15%。但是在診斷新生兒CT結(jié)膜炎時(shí)，Giemsa染色鏡檢被認(rèn)為是簡(jiǎn)便、易行而敏感的一種方法，50%-90%的涂片可見胞漿內(nèi)包涵體及大量多形核白細(xì)胞。也可將刮片標(biāo)本用甲醇固定，碘染色后鏡檢，因CT包涵體含糖原，遇碘呈棕褐色，即陽(yáng)性。

　　CT的細(xì)胞培養(yǎng)

　　1956年我國(guó)湯非凡教授首次在世界上用雞胚卵黃囊培養(yǎng)CT獲得成功。10年后，組織細(xì)胞培養(yǎng)CT成功。從病人組織中分離CT，長(zhǎng)期以來(lái)都被作為一種確診試驗(yàn)，但是非百分之百敏感，培養(yǎng)失敗常由于標(biāo)本多變或標(biāo)本收集方法不當(dāng)而引起。

　　培養(yǎng)細(xì)胞現(xiàn)多常用McCoy細(xì)胞或Hela-229細(xì)胞株[2]，BHK-21細(xì)胞也對(duì)CT易感。最初操作時(shí)使用X線照射過(guò)的McCoy細(xì)胞，現(xiàn)常用放線菌酮處理過(guò)的單細(xì)胞層。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，起決定作用的一步是將接種物離心進(jìn)入培養(yǎng)的單細(xì)胞層內(nèi)，然后所有細(xì)胞在35℃孵育48-72小時(shí)，進(jìn)行Giemsa染色、碘染色或單克隆熒光抗體染色，在光學(xué)顯微鏡下尋找CT包涵體。雖然此方法特異性高達(dá)100%。因受標(biāo)本采集、保存、轉(zhuǎn)運(yùn)和培養(yǎng)等許多因素影響，多數(shù)研究顯示敏感性僅為52%-92%[3.4]。

　　CT的抗原檢測(cè)

　　一、酶免疫測(cè)定（EIA） 此方法是將酶與單克隆抗體用交聯(lián)劑結(jié)合起來(lái)，形成酶標(biāo)抗體，檢測(cè)標(biāo)本中有無(wú)CT抗原。如有CT抗原，則與酶標(biāo)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，加入酶的底物，底物被酶催化生成可溶性或不溶性呈色產(chǎn)物，即為陽(yáng)性。可用肉眼或分光光度計(jì)定性或定量，其敏感性為93%-98%，10分鐘可出報(bào)告。

　　二、直接熒光抗體試驗(yàn)（DFA） 此方法是利用熒光標(biāo)記的單克隆抗體檢測(cè)標(biāo)本中有無(wú)CT抗原。其診斷新生兒CT結(jié)膜炎的敏感性高達(dá)95%-100%，20分鐘可出報(bào)告，但需用熒光顯微鏡觀察。Thomas等[5]用不同方法測(cè)定宮頸拭子標(biāo)本中的CT，EIA可檢出稀釋至10-5～10-6的原體（elementary body,EB）；而DFA對(duì)稀釋至10-8后的EB仍可陽(yáng)性，敏感性較EIA為高。

　　核酸擴(kuò)增技術(shù)

　　近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，核酸擴(kuò)增技術(shù)在常規(guī)感染的診斷中很快建立。這些技術(shù)主要有擴(kuò)增探針（Ampliprobe）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、連接酶鏈反應(yīng)（LCR）、核酸自身連續(xù)序列復(fù)制技術(shù)（NASBA）和Q-B復(fù)制酶試驗(yàn)。

　　一、擴(kuò)增探針?lè)ā∮捎诜桥囵B(yǎng)檢測(cè)方法不斷發(fā)展，DNA 雜交也逐漸被應(yīng)用于診斷CT感染。通常這些實(shí)驗(yàn)特異性較高，但并非最敏感。由于需要放射性元素標(biāo)記的探針而限制了其應(yīng)用隨著分子生物學(xué)發(fā)展、硫標(biāo)記的DNA 探針及生物素標(biāo)記的DNA 探針解決了這些問(wèn)題。近年來(lái)采用DNA 探針直接檢測(cè)CT tRNA及增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光探針實(shí)驗(yàn)（PACE）提高了檢測(cè)的敏感性。擴(kuò)增探針系統(tǒng)依賴于檢測(cè)標(biāo)志的擴(kuò)增，而不是模板DNA 本身被擴(kuò)增。與預(yù)期模板互補(bǔ)的DNA 克隆進(jìn)入M13噬菌體載體，分離單鏈DNA 在固相支持物上針對(duì)模板DNA 進(jìn)行雜交，與M13噬菌體基因互補(bǔ)的第二個(gè)探針包裹載體序列，通過(guò)堿性磷酸酶而被檢測(cè)。Thomas等[5]認(rèn)為PACE dNA探針可檢出10-5CT，不如PCR敏感（PCR可檢出10-8CT）。擴(kuò)增探針?lè)z測(cè)尿液標(biāo)本CT，其敏感性和特異性分別達(dá)到92%和99%[6，7]。

　　二、PCR PCR檢測(cè)CT快速，簡(jiǎn)便，有高度敏感性和特異性。通過(guò)特異引物和Taq dNA聚合酶，在一定條件下將標(biāo)本CT靶片段擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物行電泳檢測(cè)，據(jù)凝膠上預(yù)計(jì)分子量DNA 擴(kuò)增帶的出現(xiàn)判斷結(jié)果。整個(gè)過(guò)程需4～5小時(shí)。1987年，Mullis和Faloona最早應(yīng)用DNA 聚合經(jīng)過(guò)高溫變性，降溫退火，適溫延伸三個(gè)步驟，反復(fù)循環(huán)30～40次，可將標(biāo)本中的DNA 量擴(kuò)增109～1012。Φstergaard等[8]經(jīng)過(guò)40個(gè)循環(huán)，可檢測(cè)10-17g的CT dNA，相當(dāng)于1個(gè)拷貝的質(zhì)粒，檢測(cè)敏感性和特異性分別達(dá)到100%～93%。

　　三、LCR法　1991年，Barany從生棲熱菌（Thermus aquaticus）中提取耐熱DNA 連接酶并用該酶擴(kuò)增DNA 獲得成功，正式命名為L(zhǎng)CR。LCR反應(yīng)需要兩對(duì)互補(bǔ)的寡核苷酸探針，在模板DNA 、DNA 連接酶、DNA 聚合酶存在的前提下，通過(guò)變性、復(fù)性連接的多次循環(huán)使靶DNA 大量擴(kuò)增。LCR大大地改善了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和敏感性,Stary等[9]認(rèn)為L(zhǎng)CR對(duì)各種類型的CT標(biāo)本都有很高的敏感性。文獻(xiàn)報(bào)道用LCR檢測(cè)尿標(biāo)本中CT的敏感性在95%以上，特異性有99%以上[10，11]，優(yōu)于PCR及EIA。Nikkari等[12]甚至報(bào)道在由CT引起的關(guān)節(jié)炎滑液的細(xì)胞中，LCR也檢出CT dNA，而PCR不能。標(biāo)本中抑制物可影響LCR的結(jié)果，而將標(biāo)本凍融、稀釋可減少抑制物，提高LCR的敏感性[13]。

　　四、NASBA法是一個(gè)簡(jiǎn)單、快速擴(kuò)增核酸的方法，約2小時(shí)可將RNA擴(kuò)增1010倍，它是一個(gè)持續(xù)的恒溫過(guò)程，不需要特殊的儀器。類似PCR之處是利用2個(gè)引物呈指數(shù)地?cái)U(kuò)增位于引物旁的序列，不同之處在于它需要三種酶：T7RNA聚合酶、核糖核酸酶、鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶，且反應(yīng)處于一個(gè)恒定的溫度。這三個(gè)酶產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致靶序列自身復(fù)制[14]。NASBA依靠一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)持續(xù)反復(fù)循環(huán)，由互補(bǔ)DNA 中介復(fù)制RNA模板，寡核苷酸鏈引導(dǎo)DNA 合成，并為T7RNA聚合酶編碼啟動(dòng)子序列。反應(yīng)中首先合成雙鏈cDNA ，該cDNA 作為T7RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄模板。而完成cDNA 合成有賴于核糖核酸酶消化分解作為中介物的RNA-DNA 雜交物中的RNA。足夠轉(zhuǎn)錄的cDNA 產(chǎn)生原始模板的反義RNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成為含有雙鏈啟動(dòng)分子的cDNA 。這些cDNA 能產(chǎn)生有義RNA和反義RNA，二者都能重新進(jìn)入循環(huán)。NASBA擴(kuò)增的效率僅輕微受初始RNA濃度影響，擴(kuò)增產(chǎn)物的積累量與時(shí)間呈指數(shù)相關(guān)，反應(yīng)在恒溫37℃下進(jìn)行，迅速，1～2小時(shí)孵育后，反應(yīng)產(chǎn)物可擴(kuò)增107倍。擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到105倍僅需15分鐘而PCR需85分鐘[15]。Morre等[16]認(rèn)為NASBA在檢測(cè)尿標(biāo)本CT感染和宮頸標(biāo)本有同樣的敏感性，且對(duì)16S rNA最敏感，只需10-5包涵體形成單位（IFU）即可檢出，比PCR敏感10倍。

　　五、Q-β復(fù)制酶試驗(yàn) Q-β復(fù)制酶催化一條被稱為MDV-1的218個(gè)堿基的RNA模板自身復(fù)制，12分鐘內(nèi)復(fù)制酶可擴(kuò)增MDV-1模板106拷貝，該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是三明治雜交、可逆性靶捕獲和Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增。反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，4小時(shí)內(nèi)完成。檢測(cè)CT核糖體RNA和核糖體DNA 。使用2種類型的探針：一是特異性捕獲探針，另一是可復(fù)制的DNA 檢測(cè)分子[17]。由于該技術(shù)基于RNA的擴(kuò)增，而微生物體內(nèi)含有大量RNA拷貝，故能達(dá)很高的敏感性，可用于檢測(cè)活動(dòng)性感染，且Q-β復(fù)制酶試驗(yàn)受標(biāo)本中抑制物的影響比較小[18]。An等[19]認(rèn)為Q-β復(fù)制酶可檢測(cè)5個(gè)CT eB，且不受標(biāo)本中抑制物的影響。

　　自從細(xì)胞培育CT成功以來(lái)，就一直作為診斷CT感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但即使是在有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞培養(yǎng)敏感性仍然只有75%～90%。這降低了它在檢測(cè)低流行人群中CT感染的使用價(jià)值。近年來(lái)核酸擴(kuò)增方法在感染性疾病診斷中的廣泛應(yīng)用，LCR具有高度敏感性和特異性，在CT的診斷方法中的地位日趨重要，故Lee[20]提出了診斷CT感染的擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)，即（1）細(xì)胞培養(yǎng)陽(yáng)性；

（2）細(xì)胞培養(yǎng)陰性，但LCR陽(yáng)性且DFA證實(shí)。而其他核酸擴(kuò)增技術(shù)，尚需進(jìn)一步研究，但是非培養(yǎng)方法是今后CT診斷發(fā)展的趨勢(shì)。

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