正常大鼠肺泡上皮細胞的培養

實驗材料：

1. 正常大鼠的肺組織；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 肺泡灌洗液Ⅰ：140 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L磷酸緩沖液、10 mmol/L HEPES、6 mmol/L葡萄糖和0.2 mmol/L EDTA。用無菌雙蒸水配制，pH7.4，肺泡灌洗液使用時須預溫到37℃；

4. 肺泡灌洗液Ⅱ：在灌洗液Ⅰ中加入2.0 mmol/L CaCl2 和1.3 mmol/L MgSO4，混勻備用。肺泡灌洗液使用時須預溫到37℃；

5. 酶消化液：0.25%胰蛋白酶溶液和0.1%膠原酶溶液的混合液；

6. 細胞分散液：100μg/ml的DNAasc和4%的胎牛血清；

7. 培養基：多選擇DMEM，配制時添加10%胎牛血清、2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/L HEPES、100IU/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素；

8. 大鼠IgG：用于包被培養器皿。臨用前以50 mmol/L的Tris緩沖液（pH9.3）稀釋配制。用大鼠IgG包被培養皿的方法如下：

①用50 mmol/L的Tris緩沖液稀釋配制鼠IgG（0.5—1mg/mL），均勻地滴加在直徑為10cm的培養皿中；

②在37℃溫箱中處理4—6h。用灌洗液Ⅱ洗3次。最好用無血清DMEM洗1次，備用；

9. 培養器具：不銹鋼網篩（80目、200目和280目）、培養皿或瓶、手術刀、解剖剪、解剖鑷、眼科剪，眼科鑷，止血鉗，無菌消毒手術器械；

實驗方法：

1. 取雄性Wistar或SD大鼠，體重180—200g。腹腔麻醉，注射3%戊巴比妥鈉10mg/kg和肝素400U/kg。無菌條件下剖胸，切開氣管插管，動物放血致死；

2. 經氣管插管肺內通氣數次，至肺呈蒼白色（注意通氣壓不可過大，以免將組織吹破）；

3. 整體取出心、肺和氣管，并用肺泡灌洗液Ⅰ經插管肺內灌洗4—6次（每次5ml）。再用肺泡灌洗液Ⅱ灌洗2次；

4. 肺內灌注（消化液）0.25%胰蛋白酶溶液和0.1%膠原酶溶液的混合液。37℃水浴消化15—30min。每隔3—5min后添加消化液；

5. 去除心臟、氣管及肺門周圍的結締組織，在5min內快速將肺組織剪成1—2mm3 大小的組織塊；

6. 加入總量為4ml的細胞分散液，以終止消化，并將聚集成團的細胞分散；

7. 將切碎的肺組織塊倒入三角燒瓶內，用灌洗液Ⅱ補足至20ml，37℃水浴條件下晃動5min（130次/min）；

8. 懸液經80目、200目和280目不銹鋼網篩過濾；

9. 收集濾液，放入10ml尖底離心管中，以400r/min離心8—10min；

10. 棄上清液，用DMEM培養液懸浮細胞；

11. 將8—10ml細胞懸液加到用大鼠IgG包被的培養皿上，在37℃、5%CO2 的培養箱中孵育3h；

12. 收集細胞懸液，以400r/min離心8—10min后，棄上清液，再用無血清DMEM漂洗1次。

13. 用20%胎牛血清DMEM懸浮細胞，并進行細胞活力鑒定；

14. 將上述懸液的細胞計數后，調節細胞密度。按1×106 —3×106個/cm3的細胞密度接種于培養瓶或培養板中。放37℃、5%CO2 的培養箱中培養。培養24小時后換液，去除未貼壁細胞后繼續培養，以后每周換液2—3次

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