從小鼠脾臟分離小鼠天然殺傷細胞

基本方案：

由于所用Mab只能檢測C57BL背景小鼠體內的NK1.1CD3- NK細胞，故本方案適用于C57BL/6或者C57BL/10（以及H2b 、d、q 同系小鼠）小鼠脾臟細胞。

清楚雜細胞所用的單克隆抗體的活性對本方案至關重要。單克隆抗體可以買到，并且其雜交瘤可以從ATCC得到，因此建議檢測單克隆抗體的活性以保證實驗成功。最佳補體和細胞濃度也需要通過實驗確定。

實驗材料：

1. C57BL/6或者C57BL/10小鼠

2. Tris/NH4Cl裂解緩沖液

3. HBSS/3%（V/V）FBS

4. 10×單克隆抗體儲存液

5. GK1.5（ATCC號TIB207）、53-6.72（TIB105）、M5/114.15.2（TIB120）、J11d.2（TIB183；PharMingen）

6. 單克隆抗體MAR18.5（TIB216；PharMingen）濃度1mg/ml

7. 含酚紅的HBSS（Life Technologies）/10%（V/V）FBS

8. 低Tox-M兔補體，無菌復溶

9. 淋巴細胞M密度梯度分離液（Accurate Chemical and Scientific），室溫

10. RPMI-10完全培養基

11. FITC標記的抗CD3抗體和PE標記的PK136抗體（PharMingen）

12. 15ml和50ml帶蓋聚丙烯錐底離心管

13. Beckman CS-6R離心機（或同類離心機）

14. 血清學吸管

實驗方法：

1. 處死小鼠，無菌取脾臟。

2. 制備脾臟細胞懸液，置于50ml離心管中，避免將纖維性雜質移入離心管。200g離心5min以洗滌細胞。采用“去除脾臟細胞懸液中的紅細胞”的方法裂解紅細胞，或使用Tris/NH4Cl裂解緩沖液。每個脾臟的細胞用1ml HBSS/3%（V/V）FBS混懸。

3. 用臺盼藍拒染法計數活細胞。用HBSS/3% FBS混懸細胞至5×107 個細胞/ml。置于冰上保存。

4. 制備下述單克隆抗體的10×混合溶液（10×每種抗體的飽和濃度）：

GK1.5（抗CD4）

35-6.72（抗CD8）

M5/114.15.2（抗I-A和I-Ed,k ）

J11d.2（抗CD24）

5. 每0.9ml細胞懸液加入0.1ml單克隆抗體混合液，4℃孵育30min。

6. 用冰的HBSS/3% FBS洗細胞2遍，4℃，200g離心5min，棄上清。用10ml冰的HBSS/3% FBS混懸細胞再洗一遍。將細胞用HBSS/10% FBS混懸至濃度5×107 個細胞/ml。

7. 加入10mg/ml抗大鼠κ（MAR18.5；1mg/ml儲存液）和低Tox-M兔補體至細胞懸液使其達到最佳終濃度（通常1：6，但需要根據經驗確定）。37℃孵育45min，每15min振搖一次。

8. 用HBSS/10% FBS洗一遍（步驟6）。

9. 用5ml HBSS/10% FBS混懸細胞。取少量細胞懸液采用臺盼藍拒染法計數活細胞，以確定補體裂解效果。

10. 將5ml室溫的淋巴細胞M密度梯度分離液加入到一個15ml離心管中。將5ml細胞懸液輕輕加在分離液上。室溫，200g離心20min，使離心速度緩慢下降。

11. 用吸管從界面小心吸取液體，放在另一個15ml離心管中。必要時可將界面放在白色背景前以便看清。用RPMI-10完全培養基洗2遍（方法同步驟6）。臺盼藍染色計數活細胞，備用。

12. 為檢驗細胞純度，可加入終濃度為10mg/ml的抗CD3-FITC和PK136-PE（抗NK1.1）抗體，進行流式分析。

附錄：

HBSS/10%（V/V）FBS和HBSS/3%（V/V）FBS：56℃ 45min熱滅活FBS，過濾。取HBSS，加入不同量的FBS，分別配置含10%和3%（V/V）FBS的HBSS溶液。在10%FBS的HBSS溶液中加入酚紅，而3%FBS的溶液不加酚紅，以示區分。4℃可保存6個月。

大鼠補體，低Tox-M，無菌復溶：將凍干的低Tox-M大鼠補體（Accurate Chemical and Scientific）用無菌的HPLC級的純水溶解，臨用前配置。如需要，可以用0.45mm濾膜過濾除菌。滴定法測定每批次產品的細胞毒活性。記住始終置于冰上操作。凍存時迅速置入-70℃冰箱中，于-70℃可保存6個月。

Tris/NH4Cl裂解緩沖液：90ml 0.16mol/L（8.3g/L）NH4Cl；10ml 0.17mol/L Tris·Cl，pH7.65；用HCl調pH至7.2；過濾除菌；室溫可保存3個月

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