細胞單克隆的分離方法

一、有限稀釋法

材料：

a、96孔細胞培養板等；

b、HT培養基；

c、活力強的雜交瘤細胞；

d、小鼠腹腔細胞。

方法：

a、制備小鼠腹腔細胞。同“細胞融合”一節中的方法。

b、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞三種不同的稀釋度。

c、按每毫升加入5×104-1×105細胞的比例，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。

d、每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數分別為0.5、3和10。

e、37℃、7.5% CO2濕潤培養7-10天，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。

f、取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養，并凍存。

g、本法中（b）、（c）、（d）也可簡化為將計數后的雜交瘤細胞準確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細胞，按每孔接種0.1ml細胞懸液，即每孔含1個細胞。

二、軟瓊脂法

材料：

a、HT培養基（雙倍濃度）。

b、用0.15mol/L NaCl配制的2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細胞培養用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121℃高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4℃保存。

c、小鼠腹腔細胞。

d、滅菌平皿。

e、45℃水浴。

f、活力很好的雜交瘤細胞。

方法：

a、在培養皿中制備飼養細胞（小鼠腹腔細胞）單層。

b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養液混勻，配成1%瓊脂糖培養液，45℃水浴中溫育。

c、吸去平皿上層培養液，加入1%瓊脂糖培養液3ml，室溫10分鐘。

d、取雜交瘤細胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養液1ml混勻，鋪于上層。

e、37℃、7.5%濕潤培養7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養細胞的24孔板，擴大培養。

f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續克隆化，或擴大培養、凍存。

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