薄層色譜的原理及應(yīng)用要點(diǎn)
薄層色譜,或稱薄層層析(thin-layer chromatography),是以涂布于支持板上的支持物作為固定相,以合適的溶劑為流動(dòng)相,對(duì)混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、氨基酸、核苷酸、生物堿及其他多種物質(zhì)的特別有效的層析方法,從50年代發(fā)展起來至今,仍被廣泛采用。
一、基本原理
薄層層析是把支持物均勻涂布于支持板(常用玻璃板,也可用滌綸布等)上形成薄層,然后用相應(yīng)的溶劑進(jìn)行展開。薄層層析可根據(jù)作為固定相的支持物不同,分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。
吸附是表面的一個(gè)重要性質(zhì)。任何兩個(gè)相都可以形成表面,吸附就是其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解于其中的溶質(zhì)在此表面上的密集現(xiàn)象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上,都可能發(fā)生吸附現(xiàn)象。
物質(zhì)分子之所以能在固體表面停留,這是因?yàn)楣腆w表面的分子(離子或原子)和固體內(nèi)部分子所受的吸引力不相等。在固體內(nèi)部,分子之間相互作用的力是對(duì)稱的,其力場(chǎng)互相抵消。而處于固體表面的分子所受的力是不對(duì)稱的,向內(nèi)的一面受到固體內(nèi)部分子的作用力大,而表面層所受的作用力小,因而氣體或溶質(zhì)分子在運(yùn)動(dòng)中遇到固體表面時(shí)受到這種剩余力的影響,就會(huì)被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的,被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡,稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡與不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過程。
例如用硅膠和氧化鋁作支持劑,其主要原理是吸附力與分配系數(shù)的不同,使混合物得以分離。當(dāng)溶劑沿著吸附劑移動(dòng)時(shí),帶著樣品中的各組分一起移動(dòng),同時(shí)發(fā)生連續(xù)吸附與解吸作用以及反復(fù)分配作用。由于各組分在溶劑中的溶解度不同,以及吸附劑對(duì)它們的吸附能力的差異,最終將混合物分離成一系列斑點(diǎn)。如作為標(biāo)準(zhǔn)的化合物在層析薄板上一起展開,則可以根據(jù)這些已知化合物的Rf值(后面介紹Rf值)對(duì)各斑點(diǎn)的組分進(jìn)行鑒定,同時(shí)也可以進(jìn)一步采用某些方法加以定量。
薄層層析有許多優(yōu)點(diǎn):它保持了操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、顯色容易等特點(diǎn),同時(shí)展開速率快,一般僅需15~20分鐘;混合物易分離,分辨力一般比以往的紙層析高10~100倍,它既適用于只有0.01μg的樣品分離,又能分離大于500mg的樣品作制備用,而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點(diǎn)是對(duì)生物高分子的分離效果不甚理想。
二、固定相支持劑的選擇和處理
在薄層層析時(shí),對(duì)支持劑的選擇主要考慮兩方面:一是支持劑的性質(zhì)與適用范圍;二是支持劑的顆粒大小。一般來說,所選吸附劑應(yīng)具有最大的比表面積和足夠的吸附能力,它對(duì)欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)有不同的吸附能力,即有足夠的分辨力;所選吸附劑與溶劑及樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。吸附力的強(qiáng)弱規(guī)律可概括如下:吸附力與兩相間界面張力的降低成正比,某物質(zhì)溶液中被吸附的程度與其在溶劑中的溶解度成反比。極性吸附劑易吸附極性物質(zhì),非極性吸附劑易吸附非極性物質(zhì)。同族化合物的吸附程度有一定的變化方向,例如,同系物極性遞減,而被非極性表面吸附的能力將遞增。
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