細胞自噬概念及研究

什么是自噬？

細胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又稱為Ⅱ型細胞死亡，是細胞在自噬相關基因(autophagyrelated gene，Atg)的調控下利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程。

比利時科學家Christian de Duve在上世紀50年代經過電鏡察看到自噬體（autophagosome）構造，并且在1963年溶酶體國際會議上首先提出了"自噬"這種說法。因而Christian de Duve被公以為自噬研討的鼻祖。Christian de Duve也因發現溶酶體，于1974年取得諾貝爾獎。

目前根據發生過程分為三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。

大自噬（Macroautophagy）即我們說的自噬（autophagy）;

微自噬（Microautophagy）：是指溶酶體主動、直接吞噬胞漿成分的一種方式;

分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侶，如hsp70，能幫助未折疊蛋白轉位入溶酶體。通常說的自噬泛指Macroautophagy.

自噬的過程

1）細胞接受自噬誘導信號后，在胞漿的某處形成一個小的類似"脂質體"樣的膜結構，然后不斷擴張，被稱為Phagophore。

2）Phagophore不斷延伸，將胞漿中的任何成分，全部攬入，然后"收口"，成為密閉的球狀的autophagosome，即"自噬體"。

3）自噬體形成后，可與細胞內吞的吞噬泡、吞飲泡和內體融合（這種情況不是必然要發生的）。

4）自噬體與溶酶體融合形成autolysosome，期間自噬體的內膜被溶酶體酶降解，2者的內容物合為一體，自噬體中的"貨物"也被降解，產物（氨基酸、脂肪酸等）被輸送到胞漿中，供細胞重新利用，而殘渣或被排出細胞外或滯留在胞漿中。

自噬的調控

1. 依賴mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶點）途徑的自噬

1）PI3K-AKT-mTOR信號通路

2）AMPK-TSC 1/2-mTOR 信號通路

2. 其它的信號通路

1）3-甲基腺嘌呤（3-MA）通過抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬。

2）beclin1和UVRAG作為正調控子，抗凋亡因子bcl-2作為負調控子共同參與組成Class ⅢPI3 復合物調控自噬。

3）GTP結合的G蛋白亞基Gαi3抑制自噬；GDP結合的Gαi3蛋白活化自噬。

4）死亡相關蛋白激酶（death-associated proteinlinase,DAPK）和DAPK相關蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）誘導自噬。

5）PKA、casein激酶 Ⅱ、MAP激酶、calcium途徑也在自噬錯綜復雜的調控網格中，但其機制還不甚清楚。

自噬與疾病

1. 自噬與代謝

自噬能清除不正常構型的蛋白質，并消化受損和多余的細胞器，是真核細胞中廣泛存在的降解/再循環系統。

在細胞新陳代謝、結構重建、生長發育中起著重要作用。

在饑餓和新生兒早期，自噬作用明顯加強，自噬體顯著增多。

2. 自噬與腫瘤

細胞自噬與腫瘤的關系十分復雜，目前尚未完全闡明。

一方面，正常細胞自噬增強，可表現出抑制腫瘤發生的功能；與此相反，抑制細胞自噬有潛在的致瘤可能。

另一方面，腫瘤細胞也可通過增強細胞自噬來對抗由缺氧、代謝產物、治療藥物誘導的應激反應。

細胞自噬研究

細胞自噬的研究是目前生物醫學領域熱點之一，廣泛參與各種生理和病理過程。目前普遍采用的自噬檢測方法包括電鏡、免疫熒光、蛋白質印跡等方法檢測自噬體及其標志蛋白。

正常培養的細胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，通常使用的工具藥有：

自噬誘導劑

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin：mTOR抑制劑

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

自噬抑制劑

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑

(2) Bafilomycin A1：質子泵抑制劑

(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

自噬過程的檢測

目前，人們對自噬的檢測主要包括基于檢測自噬體的直接(觀察自噬體的形態)和間接(檢測自噬體表面蛋白標記)的方法以及基于自噬性降解原理設計的一些方法。除此之外，還可通過對自噬通路的調控來全面評價自噬功能對細胞行為或機體功能的影響，如自噬抑制或激活劑、自噬相關基因的敲除及沉默等。

除了電鏡下的形態學觀察外，自噬體標記蛋白LC3的檢測是目前常用的方法，在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成，更有mRFP-GFP-LC3雙標蛋白的自噬檢測等。

雙熒光LC3細胞自噬腺病毒

mRFP 用于標記及追蹤LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，即由于GFP熒光蛋白對酸性敏感，當自噬體與溶酶體融合后GFP 熒光發生淬滅,此時只能檢測到紅色熒光。

我們在顯微鏡成像后紅綠熒光merge后通過merge后出現的黃色斑點即只是自噬體.紅色的斑點指示自噬溶酶體,通過不同顏色斑點的計數可以清晰的看出自噬流的強弱。

如下圖:細胞轉染mRFP-GFP-LC3病毒后給予氨基酸剝奪處理2小時后出現明顯增強的自噬以及自噬流。

紅色斑點是自噬溶酶體（mRFP），黃色斑點是自噬體（RFP+GFP）. 通過不同顏色斑點的計數可以清晰看出自噬流的強弱，實時監測自噬發生過程，準確，清晰，直觀！

研究的深入對自噬的檢測方法也提出了更高的要求，自噬功能障礙包括自噬體形成和降解障礙。因此，準確全面地評估自噬不僅包括自噬體的檢測，還包括動態觀察整個自噬性降解的過程是否順暢(即自噬潮分析)。

另外，通過藥物或基因干預技術來人為地調控自噬以觀察其在體內體外模型中的作用也是自噬分析的重要內容。需要注意的是，任何一種方法單獨應用均不能作為自噬的依據。對任何方法得到的結果進行解釋時必須慎重，特別是不能將自噬體的增多減少或自噬相關蛋白表達的高低等同于自噬的增強或減弱。

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