細胞染色常用染色試劑及細胞染色方法
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細胞染色常用方法
細胞染色常用方法主要包括以下幾個即:1.簡單染色法,常用堿性染料如美藍等進行簡單染色;2.革蘭氏染色法,主要包括結晶紫初染、碘液媒染、乙醇(或丙酮)脫色以及番紅復染四個過程;3.瑞氏染色法,瑞氏染料溶劑主要是由伊紅美藍組成;4.吉姆薩染色法,吉姆薩染色原理與結果和瑞特染色法基本相同;6.細胞免疫熒光染色法,免疫熒光染色的主要原理是利用抗原 抗體之間的特異性結合。
十五種細胞染色試劑
1、 酸性品紅(Acid fuchsin)酸性品紅是酸性染料,呈紅色粉末狀,能容於水,略溶於酒精(0.3%)。是良好的細胞制染色劑,在動物制片上應用很廣,在植物制片上用來染皮層、髓部等薄壁細胞和纖維素壁。它跟甲基綠同染,能顯示線粒體 。組織切片在染色前先浸在帶酸性的水中,可增強它的染色力。酸性品紅容易跟堿起作用,所以染色過度,易在自來水中褪色。
2、 剛果紅(Congo red)剛果紅是酸性染料,呈棗紅色粉末狀,能溶於水喝酒精,遇酸呈藍色。它能作染料,也用作指示劑。它在植物 制片中常作為蘇木精或其他細胞染料的襯墊劑。用來染細胞質時,能把膠制或纖維素染成紅色。在動物組織制片中用來染神經軸、彈性纖維、胚胎材料等。剛果紅可以跟蘇木靜作二重染色,也可用作類淀粉染色,由於它能溶於水和酒精,所以洗滌和脫水處理要迅速
3、甲基藍(Methyl blue)甲基藍是弱酸性染料,能溶於水和酒精。甲基藍在動植物的制片技術方面應用極廣。它跟伊紅合用能染神經細胞,也是細菌 制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生動物的活體染色劑。甲基藍極易氧化,因此用它染色后不能長久保存。
4、固綠(Fast green)固綠是酸性染料,能溶於水(溶解度為4%)和酒精(溶解度為9%)。固綠是一種染含有漿質的纖維素細胞組織的染色劑,在染細胞和植物 組織上應用極廣。它和蘇木精、番紅并列為植物組織學上三中最常用的染料。
它和蘇木精、番紅并列為植物組織學上三中最常用的染料。
5.苯胺藍(Aniline blue)是一種混合酸性染料,平常所用很難有一定的標準。此染料一般很難溶於水,也不易溶於酒精(1.5%)。植物制片中可與番紅合用,作為組織染色;也可作藻類植物染色。因為這種染料的成分很不一致,染色效果不易掌握。
6、蘇丹Ⅲ (Sudan Ⅲ)蘇丹Ⅲ是弱酸性染料,不溶解於水,呈紅色粉末狀,易溶於脂肪和酒精(溶解度為0.15%)。常用70%酒精中的飽和溶液。蘇丹Ⅲ是脂肪染色劑。
7、蘇丹Ⅳ (Sudan Ⅳ)蘇丹Ⅳ是弱酸性染料,也是很好的染脂肪染料,現在多用以代替蘇丹Ⅲ,可染樹脂、乳汁管、蠟質以及角質等結構,也可使葉綠體染成暗紅色。
s8、伊紅(Eosin)這類染料種類很多。常用的伊紅Y,是酸性染料,呈紅色帶藍的小結晶或棕色粉末狀,溶於水(15攝氏度是溶解度達44%)和酒精(溶於無水酒精的溶解度為2%)。伊紅在動物制片中廣泛應用,是很好的細胞質染料,常用作蘇木精的襯染劑。
9、堿性品(復)紅(Basic fuchsin)堿性品紅是堿性染料,呈暗紅色粉末或結晶狀,能溶於水(溶解度1%)和酒精(溶解度8%)。堿性品紅在生物學制片中用途很廣,可用來染色膠原纖維、彈性纖維、嗜復紅性顆粒和中樞神經組織的核質。在生物學制片中用來染維管束植物的木質化壁,又作為原球藻、輪藻的整體染色。在細菌學制片中,長用來鑒別結核桿菌。在爾根氏回應中用作組織化學試劑,已核查脫氧核糖核酸。
10、 結晶紫(Crystal violet)結晶紫是堿性染料,能溶於水(溶解度9%)和酒精(溶解度8.75%)。結晶紫在細胞學、組織學和細菌學等方面應用極廣,是一種優良的染色劑。它是細胞核染色常用的,用來顯示染色體的中心體,并可染淀粉、纖維蛋白、神經膠質等。凡是用番紅和蘇木精或其他染料染細胞核不能成功時,用它能得到良好的結果。用番紅和結晶紫作染色體的二重染色,染色體染成紅色,紡錘絲染成紫色,所以也是一種顯示細胞分裂的優良染色劑。用結晶紫染纖毛,效果也很好。用結晶紫染色的切片,缺點是不易長久儲存。
11、龍膽紫 (Gentian violet)龍膽紫是混合的堿性染料,主要是結晶紫和甲基紫的混合物。在必要是,龍膽紫能跟結晶紫互相替用。醫藥上用的紫藥水,主要成分是甲基紫,需要時能代替龍膽紫和結晶紫
12、 中性紅(Neutral red)中性紅是弱堿性染料,呈紅色粉末狀,能溶於水(溶解度4%)和酒精(溶解度1.8%)。它的堿性溶液中呈現黃色,在強堿性溶液中呈藍色,而在弱酸性溶液中呈紅色,所以能用作指示劑。中性紅無毒,常做活體染色的染料,用來染原生動物和顯示動植物組織中活細胞的內含物等。陳久的中性紅水溶液,用作顯示尼爾體的常用染料。
13、番紅(Safranin)番紅是堿性染料,能溶於水和酒精。番紅是細胞學和動植物組織學生常用的染料,能染細胞核、染色體和植物蛋白質,示維管束植物木質化、木栓化和角質化的組織,還能染孢子囊。
14、亞甲藍或美藍(Methylene blue)亞甲藍或美藍是堿性染料,呈藍色粉末狀,能溶於水(溶解度9.5%)和酒精(溶解度6%)。亞甲藍是動物學和細胞學染色上十分重要的細胞核染料,其優點是染色不會過深。
15、甲基綠(methyl green)甲基綠是堿性染料。它是綠色粉末狀,能溶於水(溶解度8%)和酒精(溶解度3%)。甲基綠是最有價值的細胞和染色劑,細胞學上常用來染染色質,跟酸性品紅一起可作植物木質部的染色
我們實驗室常用的細胞染色方法
細胞染色
(1) 消化收集細胞,以2-10×103 cell/coverslip 接種細胞于24孔板中,滴加細胞懸液50-100μl,2小時后補加10%FBS+DMEM500μl
(2) 37℃細胞培養箱中培養48小時后,顯微鏡下觀察,取細胞狀態和細胞數量適應的玻片做染色。
(3) 去掉舊培養液,用冰冷的PBS洗兩次,加3.7-4%甲醛0.5ml(in PBS)室溫固定10min
(4) PBS洗兩次,加穿膜液0.5ml(0.1%triton X-100+0.1M Gycine)冰上30min
(5) PBS洗兩次,加5mg/ml BSA 0.3ml室溫封閉1小時。
(6) PBS洗兩次,取一張封口膜,做好標記,加一抗(用5mg/ml BSA稀釋1:50-100)25μl于封口膜上,將蓋玻片細胞面朝下反扣在一抗液滴上,放在濕盒中室溫孵育1-3小時
將蓋玻片從封口膜上小心夾起,細胞面朝上放入原來的24孔板中,PBS洗兩次,取另外一張封口膜,做好標記,加二抗(羊抗兔羅丹明,用5mg/ml BSA稀釋1:50-100)25μl于封口膜上,將蓋玻片細胞面朝下反扣在一{二}抗液滴上,放在濕盒中室溫黑暗中孵育1-3小時
(7) 同上PBS洗兩次,同上操作,將玻片與10μl DAPI (1μg/ml in PBS,貯存液:1mg/ml in dd H2O) 室溫孵育1-5min.
(8) PBS 洗三次,將玻片背面的水分擦干,封片于載玻片上,做好標記(時間,細胞名稱,實驗內容,號碼)
(9) 待封片膠干后可在熒光顯微鏡下觀察,觀察時注意記錄每張玻片的內容以免混淆,觀察完后將玻片放-20℃保存。
(10) 若只觀察轉染了EYFP的熒光蛋白,不需要給內源蛋白染色,可直接用DAPI染核后封片。
(11) 以BSA (5mg/ml)代替一抗,二抗照加為染色的對照組,做法同上。為了保證實驗有重復性,每次做平行2組以上。
10. 蓋玻片的處理
(1) 10×10的蓋玻片用醫用酒精浸泡過夜(若玻片較臟,可浸泡酸液過夜,用自來水沖洗十幾遍后用雙蒸水沖三四遍,晾干,用酒精泡過夜,以下步驟同)
(2) 將酒精倒掉,晾干。
(3) 準備干凈塑料15ml離心管,用蒸餾水稀釋多聚賴氨酸1:10后室溫浸泡蓋玻片5min(如果室溫小于15℃時延長至10min),撈出后于工作臺晾干后,密封后可保存半年以上。
(4) 上述稀釋液可反復浸泡,一般每瓶多聚賴氨酸可夠100-200張玻片使用,稀釋液保存于4℃,三個月內仍可使用。
DAPI(4,6-聯脒-2-苯基吲哚)是一種熒光染料,主要用于檢測細胞凋亡,DAPI可以穿過細胞膜結合DNA產生比自身強20倍的熒光信號,經過染色后可以利用流式細胞儀觀察DAPI標記的細胞
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