骨髓間充質干細胞分離培養經驗
骨髓間充質干細胞總結
2003年8月，為給大家提供一個網上交流干細胞研究經驗的平臺，我們干細胞版設立了骨髓間充質干細胞培養討論區，經過近三個月的討論學習，我們既學習豐富了自己的知識體系，也對間充質干細胞尤其是分離培養方面有了更為詳實的認識，為了大家閱讀的方便，我們決定把本版中的相關內容，同時參考部分書目和文獻，做一總結。
一、骨髓間充質干細胞的分離
目前常用的分離MSC的方法有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據干細胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化MSC的目的。密度梯度離心法即根據骨髓中細胞成分比重的不同，提取單核細胞進行貼壁培養。隨著對MSC表面抗原認識的深入，有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化，但經過流式或磁珠分選后的細胞出現了增殖緩慢等一些問題，加之耗費較大和技術的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應用。
1. 直接培養法（全骨髓培養法）
1987年，Friedenstein等發現在塑料培養皿中培養的貼壁的骨髓單個核細胞在一定條件下可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞，而且這些細胞擴增20－30代后仍能保持其多向分化潛能，這類細胞即為骨髓間充質干細胞（BMSC），其工作對今后MSC的研究具有重要意義，不僅證實了骨髓MSC的存在，而且創建了一種體外分離和培養MSC的簡便可行的方法，得到了廣泛的應用。
culture-spirit采用直接貼壁法，24-36小時首次換液，換液時用PBS洗兩次，7-10天傳第一代，以后2-3天傳代。培養基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（頂級），得到了較好的培養結果。
布蘭卡根據自己培養大鼠MSC的經驗，詳細介紹了實驗步驟：
（1）接種后60-80分鐘,換液去除懸浮細胞
（2）原代培養24 h,48 h各換液一次
（3）觀察細胞情況，在原代培養7天左右時，如觀察到成片的典型形態的細胞，在瓶底用Marker筆標記，0.25%胰酶消化，鏡下觀察控制，約5-10分鐘（室溫太低時應放置到孵箱中），加入全培養基終止消化，瓶體朝上，吸管輕輕吹打4-8分鐘，尤其是標記部位。不要用力吹打，以免把貼壁較牢的成纖維細胞，上皮樣細胞吹打下來。
（4）傳代到新瓶中，加入少量培養基，孵箱靜置20-30分鐘后，MSC大多牢固貼壁。瓶底朝上，輕輕吹打，丟棄懸浮以及貼壁不牢的細胞（大多是上皮樣細胞），加入全培養基開始傳代培養，如觀察仍有較多雜細胞，可重復上述步驟。
（5）經上述處理后，原代的那瓶細胞仍有一些MSC生長，可繼續按原代培養，如觀察到MSC的克隆，仍可按上述步驟純化處理。
（6）原代或傳代的細胞如觀察的少量成片的雜細胞，可直接鏡下瓶底標記后，超凈臺里用長吸管尖端機械刮除，吸出去掉。
菊花與刀用的是全骨髓培養法，直接用含10%的FBS培養基沖洗大鼠的股骨和脛骨，為了避免沖起許多氣泡應緩慢沖，沖的次數不應太多。沖洗后不用離心直接接種在培養瓶里，48 h~72 h后首次換液，一般7~10天可傳代。
天之餃子介紹的小鼠MSC的分離方法：取6 w小鼠的股骨和脛骨，直接用含培養基沖出骨髓，一定要盡量把干垢端的骨髓沖干凈。沖洗后不離心直接接種在培養瓶里，24－48 h后去懸浮，再接下來的每3－4天換液一次，直到需要傳代。
2. 密度梯度離心法
裴雪濤等用比重為1.073 g/ml的percoll分離（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面處細胞層，離心后洗滌以2×105/cm2的密度接種，72 h后更換培養液，棄掉未貼壁細胞，以后每3 d換液一次。細胞長到80％匯合時1：1傳代。
菊花與刀利用PERCOLL密度1.073分離大鼠MSC 時，用2400 rpm×20 mins后可見中間有一層約1～2 mm厚的白色層，仔細用吸管吸取這一層再用PBS離心2遍即可加培養基和胎牛血清培養即rMSCs。
周進明等利用密度為1.082的percoll分離小鼠MSCs，500g×30min離心后，取中間的單個核細胞層，PBS洗兩次，接種于IMDM培養基，1 d后換液，去掉非貼壁細胞，以后每3-4天換液。
jetter用過FICOLL,FERCOLL,上海二分廠的淋巴細胞分離液分離MSC細胞效果都不錯，當然所獲細胞群的純度不一，Percoll最純，而上海二分廠的淋巴細胞分離液所獲細胞群的傳代能力優秀（35 PASSAGE）。
本版的部分園友認為MSC貼壁培養得到的細胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分離得到的細胞較為均一，多能分化性和增殖力不如貼壁培養的，尤其是增殖力相差很遠，有人添加bFGF或/和表皮生長因子發現可以增強增殖能力。
二、骨髓間充質干細胞的培養
天之餃子認為，間質干細胞的培養一定要用塑料培養瓶，不能用玻璃的。因為象間質干這類的基質細胞不易貼玻璃，而且現在買的進口好品牌的培養瓶都涂有一層促細胞貼壁的物質，多數園友培養時都添加10－15％胎牛血清。
分離培養結果的差異可能是由于各個研究小組標本來源、采用的分離方法不同從而所獲得的細胞不同，或者用來檢測的細胞代數不同，或者培養過程中用的胎牛血清不同，導致MSCs獲得或失去這些表面標記物的表達。
三、骨髓間充質干細胞的特性
體外培養的MSC體積小，成梭形，核漿比大。不表達分化相關的細胞標志，如I、II、III型膠原、堿性磷酸酶或Osteopontin；也不表達SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多種表面蛋白，這群細胞特性穩定，擴增一代和兩代后的細胞同質性分別達到95％和98％。MSC聯系傳代培養和冷凍保存后仍能具有多向分化潛能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自發分化，在體外特定的誘導條件下，MSC可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉、神經等多種細胞。
四、其他相關內容
Jiang將從成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分離的間充質干細胞（CD45－TER119－）命名為多潛能成年祖細胞，他們證明，MAPC高表達端粒酶，而且隨著細胞的擴增，端粒的長度不變，單個MAPC來源的細胞群不僅能在體外向3個胚層的細胞分化，而且能在體內能夠向各種組織細胞分化，相比較而言，形態與MSC相似的體外培養的皮膚成纖維細胞則不具有類似的分化潛能。
參考文獻
生理學報2003.55（2）：153－159 人骨髓間充質干細胞在成年大鼠腦內的遷移及分化
中華放射醫學與防護雜志.2002,22(3).-167-169 培養小鼠骨髓間充質干細胞及其移植后在體內的定位分布
Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem Cells
NATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow
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