干細胞成骨誘導后的染色方法和步驟
堿性磷酸酶（ALP）是成熟成骨細胞的標志性酶，同時成骨細胞形成的鈣結節也是成骨細胞的標記物。
以ALP為目標物的檢測方法：
1 Gomori鈣鈷法
【染色原理】
ALP在pH值9.4的環境下，以鎂離子作為激活劑，能夠把β-甘油磷酸鈉水解出磷酸，磷酸與高濃度的鈣鹽結合形成無色的磷酸鈣，再與硝酸鈷作用形成磷酸鈷，經硫化胺處理形成黑色的硫化鈷沉淀在酶活性處。
【孵育液配制】
3%β-甘油磷酸鈉5ml
2%巴比妥鈉5ml
蒸餾水10ml
2% CaCl2 10ml
2% MgSO4 1ml
【步驟】
（1）將無菌的玻片放入培養皿中，傳代時加入適量的細胞懸液，作細胞爬片，呆細胞長滿玻片后取出。
（2）PBS沖洗后用冷丙醇固定10min，蒸餾水沖洗數次。
（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自來水沖洗數次。
（4）2%硝酸鈷中浸3-5min，蒸餾水洗數次。
（5）1%的硫化銨中2min，自來水沖洗，自然干燥，封固。
【結果】胞質中陽性反應呈現灰黑色顆?；驂K狀沉淀。
2 偶氮偶聯法：
【孵育液配制】
萘酚AS-BI磷酸鹽 20mg
DMSO 0.5ml
0.2mol/L巴比妥醋酸緩沖液（PH 9.2） 50ml
六偶氮副品紅0.5ml
1mol/L NaOH調PH 9-10，混合后過濾使用。
（六偶氮副品紅：副品紅400mg，濃鹽酸2ml，雙蒸水8ml混合過濾；臨用前與等體積4%亞硝酸鈉混合）
【步驟】
（1）細胞爬片成功后，PBS沖洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。
（2）蒸餾水沖洗。
（3）將過濾孵液直接滴加于玻片上，室溫下作用45min。
（4）流水沖洗，晾干。
（5）甘油明膠封固。
【結果】成骨細胞胞質中可見紅色ALP陽性顆粒。
3 堿性磷酸酶染色試劑盒法：
【作用原理】 細胞內堿性磷酸酶在Ph9.4-9.6條件下水解磷酸萘酚AS-MX產生萘酚，后者被重氮鹽捕獲，生成不溶性有色沉淀。
【作用液配制】
取2號儲備液10ml，加3號液200ul，再加4號粉劑10mg，振搖速溶，立即過濾到細胞爬片上。
【步驟】
（1）細胞爬片滴加數滴1號液，室溫固定一分鐘（不可以延長），流水漂洗2分，晾干。
（2）滴加作用液數滴，置濕盒內于37℃孵育2小時，流水沖洗2分鐘。
（3）滴加5號液數滴，復染5分鐘，流水沖洗2分鐘，晾干。
【結果】陽性結果是胞漿內出現藍色沉淀。
針對鈣沉積物“鈣結節”的染色方法：
4 茜素紅法
【作用原理】利用沉積的鈣于茜素紅發生顯色反應，得到紅色的染色效果。
【步驟】
（1）培養皿用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10min，雙蒸水沖洗3次。
（2）0.1%茜素紅-Tris-Hcl（PH 8.3）37℃，30min。
（3）蒸餾水沖洗，干燥，封片。
【結果】染料品種的不同，礦化結節呈現不同的紅色。
5 von Kossa法
【作用原理】
Von Kossa’s礦化結節染色法原理是將礦化基質中的磷酸鹽(鈣)、碳酸鹽(鈣)轉變為磷酸銀、碳酸銀，然后用日光、紫外線或強還原劑使其還原為黑色的金屬銀。本試驗染色過程中未作細胞襯染。
【步驟】
（1）培養皿用PBS沖洗2次，4％多聚甲醛固定5分鐘，雙蒸水沖洗3次。
（2）培養皿中加入5％硝酸銀溶液1ml，將培養板開蓋在紫外燈下照射1小時。
（3）倒出殘留的硝酸銀溶液，蒸餾水沖洗3遍。
（4）培養皿中加入5％硫代硫酸鈉溶液1ml，中和殘留的硝酸銀溶液，吸出殘液。
（5）室溫下晾干，封固。
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