動物細胞培養中Hanks液、D-Hanks液和消化液的配制方法

Hanks液可以維系細胞正常滲透壓與pH，本文主要記錄了動物細胞培養 中Hanks液、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制方法及其注意事項。

動物細胞培養: 

Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制

實驗目的： 

熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。

實驗原理：

Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細胞生長狀態下的pH值、滲透壓及無菌狀態一致，且配方簡單，是組織培養基本用液，常用于配制培養基及其他用液，或洗細胞等，細胞在BSS中可生存幾個小時。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細胞消化液，原代培養 時用于處理組織塊，使細胞分離下來。傳代時用胰蛋白酶使培養細胞離開所貼附的培養瓶表面，并分散成單個細胞。胰蛋白酶主要采自牛或豬的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實驗室一般用1：250(GRC公司生產)。胰蛋白酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時間長，則對細胞分離能力大。但超過一定程度會損傷細胞，導致細胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時消化能力最強。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力，所以配制胰酶時須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當消化結束時，可加入少量血清或含血清的培養基以終止胰酶作用。 細胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細胞培養消化組織塊則為0.1%或0.125%。

實驗材料與用品：

***材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。

***藥品：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA ，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進該5.6%NaHC03溶液使最終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。

***儀器(請參看儀器圖庫)： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。

實驗步驟：

(一)配制D-Hanks液

1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。

2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。

(二)配制Hanks液

1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。

2.配制Hanks時，需將CaCl2另溶解于100 mL的蒸餾水中。

3.依次加入上述試劑至700 mL蒸溜水中，溶解后再與CaCl2溶液一起定容至1 000 mL。

4.10磅，10 min高壓滅菌。

(三)配制胰蛋白酶消化液

1.D.Hanks液高壓滅菌之后，晾至室溫，4℃保存備用。

2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時研磨器應放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調制成糊狀。再放入4℃預冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使完全溶解。

3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調至8.0左右(胰酶作用的最適pH值)，并加入0.02%EDTA以協助消化作用。

4.濾過除菌(方法見二、培養基的配制)，-20℃凍存。

注意事項：

1.BSS的pH值應確定為7.2左右。

2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。

3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應始終保持在4℃左右。

4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時會將較大的顆粒過濾掉，不能達到真正的濃度。

5.胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。

D-hanks液和hanks液間區別是hanks液中含有MgCl2 、MgSO4 、CaCl2和葡萄糖，而D-hanks中不含有這些，D-hanks液主要用于消化液等，Ca/Mg離子可以降低消化液中胰蛋白酶的活性，嚴重影響消化的效果。所以只有D-hanks液用于消化液

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