植物原生質體融合

植物 原生質體融合在理論和實踐上都有很大的意義，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，它不僅能克服遠源雜交有性不親和障礙，也可克服傳統的通過有性雜交誘導多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠源基因導入栽培種中。原生質體融合技術可望成為作物改良的有力工具之一。

一、目的與要求
了解植物原生質體融合的基本原理及其過程。
二、基本原理
許多化學、物理學和生物學方法可誘導原生質體融合。現在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二烯（PEG）法、高Ca高pH法和電融合法。
PEG作為一種高分子 化合物，20～50％的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨和用高Ca高pH法進行清洗，使原生質體融合得以完成。
PEG誘導融合的機理：PEG由于含有醚鍵而具負極性，與水、蛋白質和碳水化合物等一些正極化集團能形成氫鍵。當PEG分子足夠長時，可作為鄰近原生質表面之間的分子橋而使之粘連。PEG也能連接Ca2＋等陽離子。Ca2＋可在一些負極化基才和PEG之間形成橋，因而促進粘連。在洗滌過程中，連接在原生質體膜上的PEG分子可被洗脫，這樣將引起電荷的紊亂和再分布，從而引起原生質體融合。高Ca高pH由于增加了質膜的流動性，因而也大大提高了融合頻率。洗滌時的滲透壓沖擊對融合也可能起作用。

三、實驗內容
1．原生質體分離
2．原生質體融合
3．融合體的識別

四、實驗步驟
1.溶液的配制
（1）酶液
1％纖維素酶
1％果膠酶
0.7mol甘露醇
0.7m mol碳酸二氫鉀
10m mol二水合氯化鈣
pH6.8~7.0
（2） PEG融合液
40% PEG (MW1500－6000)
0.3 mol 葡萄糖
3.5m mol 二水合氯化鈣
0.7mol 碳酸二氫鉀
(3) 13%CPW洗液
27.2 mg/L碳酸二氫鉀
101.0 mg/L硝酸鉀
1480.0 mg/L二水合氯化鈣
246.0 mg/L七水合硫酸鎂
0.16 mg/L碘化鉀
0.025 mg/L五水合硫酸銅
13% W/V甘露醇
pH 6.0
（4） 20％蔗糖溶液
2.原生質體的分離
將撕去表皮的植物葉片或花瓣置于酶液（去表皮面接觸酶液），在25℃黑暗條件下，酶解1～2小時。用200目網過濾除去未完全消化的葉片等殘渣。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清液。加入3～4ml13%CPW洗液，相同條件下離心2分鐘，棄上清，留1ml洗液。用滴管將混有原生質體的1ml洗液吸出，輕輕鋪于20％蔗糖溶液上（5ml離心管裝3ml20％蔗糖溶液），在1000rpm條件下離心5～10分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強狀態好的原生質體懸浮在20％蔗糖溶液與13％CPW溶液之間，破碎的細胞殘渣沉于管底。
用200ml的移液器 輕輕將狀態好的原生質體吸出（注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液），放入另一干凈的離心管中，加入4ml13％CPW洗液，1000rpm離心2分鐘，棄上清，用血球計數板調整原生質體密度為105－106之間。
1. 原生質體融合
將1～2滴原生質體混和物（密度為105－106之間）滴入小培養皿（或載玻片上），靜置8～10分鐘，相對方向加入2滴40％的PEG溶液，靜置10分鐘，依次間隔5分鐘加入0.5ml、1ml和2ml含13％甘露醇的CPW洗液洗滌，注意在第二、第三次洗液加入前，用移液器輕輕吸走部分溶液，但不能洗干，否則原生質體破碎死亡。最后用培養基洗1～2次即可進行培養。
2. 觀察
兩種原生質體加入PEG融合液后，只發生粘連，在洗滌過程中才發生膜融合，核融合通常于融合體第一次有一次分裂過程中發生。

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