香茅醛對(duì)指狀青霉孢子麥角固醇合成的影響
柑橘貯藏和運(yùn)輸期間較易發(fā)生果實(shí)侵染性病害,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。其中,指狀青霉(Penicillium digitatum)侵染引起的綠霉病是柑橘主要貯藏期真菌病害。植物精油是一類具有良好抑菌活性、不易誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生耐藥性的天然活性物質(zhì),已被廣泛證明對(duì)多種果蔬采后致病菌具有較好的抑制作用。香茅醛是存在于香茅油和桉葉油等多種植物精油中的芳香組分,對(duì)多種致病真菌具有顯著抑菌效果。
近日,湘潭大學(xué)化工學(xué)院對(duì)香茅醛對(duì)指狀青霉抑霉唑敏感菌株P(guān)ds01和抑霉唑抗性菌株P(guān)dw03麥角固醇的影響進(jìn)行了探討,以期為柑橘采后綠色防腐保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供理論參考。
1.香茅醛對(duì)Pds01與Pdw03孢子萌發(fā)的抑制作用
培養(yǎng)18 h后,Pds01和Pdw03對(duì)照組孢子完全萌發(fā),而不同含量香茅醛處理組孢子萌發(fā)均受到顯著抑制,但Pds01和Pdw03間抑制效果存在差別。對(duì)Pds01而言,0.8 μL/mL和1.6 μL/mL香茅醛處理18 h后其孢子萌發(fā)率分別為52.39%和31.87%。香茅醛對(duì)Pdw03抑制效果弱于Pds01,1.6 μL/mL處理組孢子萌發(fā)率為65.66%,而3.2 μL/mL和6.4 μL/mL香茅醛處理孢子萌發(fā)率分別為48.48%和28.34%。根據(jù)以上結(jié)果,選擇接近半抑制濃度效果的0.8 μL/mL和3.2 μL/mL香茅醛進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2 香茅醛處理后Pds01與Pdw03孢子萌發(fā)曲線
培養(yǎng)18 h后,Pds01和Pdw03對(duì)照組孢子完全萌發(fā),0.8 μL/mL和3.2 μL/mL香茅醛處理能夠顯著抑制孢子萌發(fā)。對(duì)于Pds01來(lái)說(shuō),培養(yǎng)9 h后,處理組萌發(fā)率為26%,顯著低于對(duì)照組的44%(P<0.05),說(shuō)明此時(shí)香茅醛對(duì)孢子萌發(fā)產(chǎn)生抑制;18 h后,處理組萌發(fā)率為49.33%,此時(shí)對(duì)照組孢子完全萌發(fā)。對(duì)Pdw03而言,雖然香茅醛的抑制濃度高于Pds01,但是培養(yǎng)6 h后處理組萌發(fā)率(7.78%)低于對(duì)照組(16.57%),說(shuō)明其孢子在萌發(fā)過(guò)程中對(duì)香茅醛更加敏感;培養(yǎng)18 h后,對(duì)照組孢子完全萌發(fā),此時(shí)處理組孢子萌發(fā)率僅為50.99%。
3 香茅醛對(duì)指狀青霉孢子麥角固醇與羊毛固醇含量的影響
Pds01對(duì)照組和處理組麥角固醇含量均在培養(yǎng)前10 h急劇下降,10 h后緩慢上升,但培養(yǎng)10 h和18 h時(shí),處理組麥角固醇含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。培養(yǎng)10 h,香茅醛處理組麥角固醇含量為(0.61±0.04)mg/g,僅為對(duì)照組的1/3;18 h香茅醛處理組麥角固醇含量升至(0.84±0.09)mg/g,約為對(duì)照組的1/4。Pdw03對(duì)照組麥角固醇含量在培養(yǎng)前10 h急劇下降(P<0.05),10 h后迅速上升,而處理組麥角固醇含量隨著時(shí)間延長(zhǎng),含量持續(xù)降低。在培養(yǎng)10 h和18 h,處理組麥角固醇含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。培養(yǎng)10 h,香茅醛處理組麥角固醇含量降至(0.76±0.14)mg/g,僅為對(duì)照組的1/3;18 h香茅醛處理組麥角固醇含量降至(0.54±0.03)mg/g,僅為對(duì)照組的1/14。
Pds01對(duì)照和處理組的羊毛固醇含量在10 h之前均先快速上升,10 h后均逐漸下降,但處理組羊毛固醇含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。培養(yǎng)10 h,對(duì)照組和處理組羊毛固醇含量均達(dá)到峰值,含量分別為(2.98f0.34)mg/g和(4.12±0.27)mg/g。Pdw03對(duì)照和處理組的羊毛固醇含量在10 h之前均快速上升,10 h后對(duì)照組迅速下降,處理組隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢上升,但處理組羊毛固醇含量顯著高于對(duì)照組,且含量峰值出現(xiàn)的時(shí)間存在差別。對(duì)照組含量在培養(yǎng)10 h達(dá)到峰值(3.26±0.03)mg/g,隨后其含量急劇下降。處理組羊毛固醇含量峰值(3.94±0.34)mg/g出現(xiàn)在培養(yǎng)18 h,約為對(duì)照組的2.40 倍。
4 香茅醛對(duì)Pds01和Pdw03孢子麥角固醇合成關(guān)鍵基因表達(dá)的影響
為驗(yàn)證麥角固醇和羊毛固醇含量結(jié)果,進(jìn)一步通過(guò)real-time PCR,分析香茅醛處理對(duì)指狀青霉孢子萌發(fā)過(guò)程中麥角固醇生物合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。香茅醛處理Pds01孢子后,除ERG11表達(dá)基本不受影響外,其余6 個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)均受到顯著影響。其中,ERG3基因表達(dá)隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)受到明顯抑制;ERG6基因表達(dá)在培養(yǎng)10 h有小幅上升,但與對(duì)照無(wú)顯著差異(P>0.05),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)到18 h,其表達(dá)量顯著低于對(duì)照組;ERG5、ERG7、ERG9和ERG26的基因表達(dá)在培養(yǎng)10 h均顯著高于對(duì)照組,隨著時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)下降趨勢(shì),至18 h ERG7和ERG9基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照,而ERG5和ERG26基因表達(dá)量與對(duì)照基本持平。
香茅醛處理Pdw03孢子后,ERG3、ERG6基因表達(dá)和Pds01孢子相應(yīng)基因表達(dá)存在類似趨勢(shì),但其余5 個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)量趨勢(shì)有所不同。處理組ERG5、ERG7、ERG9和ERG11基因表達(dá)量在10 h均顯著高于對(duì)照組(P<0.05),但ERG5、ERG7和ERG11基因表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)下降趨勢(shì),而ERG9基因表達(dá)呈上升趨勢(shì);至18 h時(shí),處理組ERG5和ERG7基因表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05),而ERG9和ERG11基因表達(dá)量與對(duì)照組基本持平。
5 討 論
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)香茅醛處理,Pds01和Pdw03孢子萌發(fā)率顯著降低,麥角固醇含量和羊毛固醇含量呈現(xiàn)趨勢(shì)互補(bǔ),其主要抑制的基因靶標(biāo)位點(diǎn)也有相似結(jié)果。香茅醛處理能顯著降低Pds01和Pdw03孢子麥角固醇含量,使羊毛固醇大量堆積。表明麥角固醇合成途徑中某些羊毛固醇代謝關(guān)鍵基因可能被抑制。
課題組前期研究發(fā)現(xiàn),檸檬醛處理Pds01后,ERG7基因的表達(dá)被激活,而ERG3、ERG5、ERG6和ERG11基因的表達(dá)被抑制,其中ERG11基因是導(dǎo)致麥角固醇含量降低的關(guān)鍵基因。與檸檬醛不同的是,香茅醛處理Pds01和Pdw03孢子并未導(dǎo)致ERG11表達(dá)受到抑制,表明香茅醛對(duì)Pds01和Pdw03孢子的作用位點(diǎn)可能不是ERG11,說(shuō)明不同類型萜類物質(zhì)對(duì)真菌麥角固醇途徑的調(diào)控位點(diǎn)存在差異。
香茅醛處理顯著抑制Pds01和Pdw03孢子麥角固醇合成通路中ERG3基因的表達(dá),隨著時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用更加明顯。香茅醛還可以使Pds01孢子中的ERG9和Pdw03孢子中ERG5基因表達(dá)提前達(dá)到峰值,隨后表達(dá)量逐漸下降,這可能與Pdw03中ERG11基因啟動(dòng)子部分的插入突變以及麥角固醇通路中部分基因應(yīng)答香茅醛形成的逆境有關(guān)。香茅醛處理后Pds01和Pdw03孢子中ERG6和ERG5基因加速上調(diào)表達(dá),ERG7、ERG9、ERG26基因表達(dá)量隨即上調(diào),ERG7和ERG26隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量又迅速下降,而Pdw03中的ERG9基因繼續(xù)上調(diào)表達(dá),這可能是為了補(bǔ)償因ERG3基因表達(dá)量受到抑制對(duì)麥角固醇合成造成的不利影響,但并不能完全彌補(bǔ)由于ERG3下調(diào)帶來(lái)的麥角固醇損失,隨著時(shí)間延長(zhǎng),這一現(xiàn)象表現(xiàn)更為明顯,最終表現(xiàn)為麥角固醇合成途徑受阻,羊毛固醇堆積含量增加,麥角固醇含量顯著降低。
6 結(jié) 論
香茅醛能顯著抑制指狀青霉Pds01和Pdw03孢子麥角固醇生物合成,從而抑制Pds01和Pdw03孢子萌發(fā),其作用機(jī)制主要與香茅醛處理能抑制ERG3基因表達(dá)有關(guān),說(shuō)明ERG3基因很可能是香茅醛抑制孢子萌發(fā)的潛在靶標(biāo)位點(diǎn)。