應(yīng)用拉曼光譜對(duì)比分析德氏乳桿菌保加利亞亞種細(xì)胞成分（一）

一些細(xì)菌在不利生長(zhǎng)環(huán)境下可以進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）態(tài)，這是細(xì)菌處于不良環(huán)境下的一種生存策略，處于該狀態(tài)下的細(xì)菌不能在常規(guī)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因此利用常規(guī)平板計(jì)數(shù)方法檢測(cè)容易造成假陰性結(jié)果。VBNC態(tài)的概念首次由徐懷恕于1982年提出，發(fā)現(xiàn)在河口和海洋環(huán)境中的大腸桿菌（Escherichia coli）和霍亂弧菌（Vibrio cholerae）存在VBNC態(tài)。VBNC態(tài)細(xì)菌雖然不能在普通培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但依然可以保持基本的代謝活性和基因表達(dá)。迄今為止，已有超過(guò)100 種細(xì)菌和真菌被證實(shí)可進(jìn)入VBNC態(tài)，其中細(xì)菌包括短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、大腸桿菌、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）ND02和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）等，真菌有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、星狀假絲酵母（Candida stellate）等。導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)的環(huán)境包括低pH值、滲透壓、輻射、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)和海水等。

自然界中99%以上的微生物因各種環(huán)境脅迫的驅(qū)使而處于VBNC狀態(tài)，導(dǎo)致它們不能被充分研究和利用，對(duì)細(xì)菌進(jìn)入VBNC態(tài)機(jī)理的研究被廣泛關(guān)注。VBNC態(tài)細(xì)胞和活的可培養(yǎng)細(xì)胞之間存在生理和分子水平的差異，包括細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成、基因表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)、毒力因子、代謝特性、黏附特性以及物理和化學(xué)抗性等。例如，大腸桿菌VBNC態(tài)細(xì)胞與正常細(xì)胞相比尺寸會(huì)減小。VBNC態(tài)細(xì)胞仍具有ATP消耗和低水平的代謝活動(dòng)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)一些調(diào)節(jié)因子與VBNC態(tài)細(xì)胞的誘導(dǎo)和復(fù)蘇有關(guān)，如過(guò)氧化氫酶KatG、LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子OxyR、應(yīng)激調(diào)節(jié)因子RpoS、烷基氫過(guò)氧化物還原酶亞基C（ahpC1和ahpC2）[和復(fù)蘇促進(jìn)因子Rpfs等；此外，外膜蛋白EnvZ/OmpR也被發(fā)現(xiàn)與VBNC態(tài)的形成有關(guān)。

工業(yè)化生產(chǎn)的乳酸菌也被證明存在VBNC態(tài)。乳酸菌是生產(chǎn)發(fā)酵乳、飼料等常用菌種，其中德氏乳桿菌保加利亞亞種是生產(chǎn)發(fā)酵乳常用的商業(yè)發(fā)酵菌種之一。菌株在生產(chǎn)、運(yùn)輸、貯存及應(yīng)用過(guò)程中會(huì)經(jīng)歷低溫、低pH值、真空、冷凍、干燥等不良生長(zhǎng)環(huán)境，這些不利條件不但影響菌株活性，還影響其發(fā)酵乳制品的優(yōu)良特性，進(jìn)而影響產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)地以及穩(wěn)定性。

鑒于目前對(duì)VBNC菌的研究大多集中在誘導(dǎo)條件、檢測(cè)方法、復(fù)蘇環(huán)境等方面，缺乏對(duì)該狀態(tài)下細(xì)菌活性特征的深入分析。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室篩選的一株具有優(yōu)良發(fā)酵特性的酸乳發(fā)酵劑——德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02為研究對(duì)象，將其在低溫、低pH值下進(jìn)行VBNC態(tài)誘導(dǎo)，采用單細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)分析德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態(tài)與正常細(xì)胞內(nèi)部大分子化合物變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種庫(kù)保藏和提供；MRS液體、固體培養(yǎng)基 英國(guó)Oxoid公司；LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit（L7102）美國(guó)Molecular Probes公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DM4000B正置熒光顯微鏡 德國(guó)Lecia公司；5810R高速低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；拉曼共聚焦顯微鏡系統(tǒng) 英國(guó)Horiba公司；SU8010冷場(chǎng)掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌VBNC態(tài)的誘導(dǎo)和形態(tài)觀察

將德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫靜置活化培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至第3代，鏡檢為純的菌株后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ND02按王亞利等的方法于4 ℃在MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行VBNC態(tài)誘導(dǎo)。誘導(dǎo)過(guò)程中定期通過(guò)平板計(jì)數(shù)法和熒光顯微鏡（使用LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit做染色處理）檢測(cè)細(xì)胞活性，當(dāng)平板計(jì)數(shù)結(jié)果為零而熒光顯微鏡下仍有顯綠色熒光的活細(xì)胞（顯紅色熒光的細(xì)胞為死亡態(tài)）存在時(shí)，則認(rèn)定此時(shí)的菌株ND02已完全進(jìn)入VBNC態(tài)。采用掃描電子顯微鏡觀察表觀形態(tài)并拍照。

1.3.2 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的拉曼信號(hào)采集

取正常、VBNC態(tài)德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02各3 個(gè)平行樣本，室溫5 200 r/min離心3 min收集菌體，然后用ddH2O輕輕吹打，洗滌3 次后將其適當(dāng)稀釋?zhuān)辜?xì)胞均勻分散于視野中，以便進(jìn)行SCRS的采集。然后吸取1.5 μL細(xì)胞稀釋?xiě)乙河贑aF2平板上，風(fēng)干后，立即采用100 mW×532 nm激光的拉曼系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)采集，照射于細(xì)胞上的激光光強(qiáng)控制為約25 mW，每個(gè)圖譜采集10 s，每個(gè)平行樣本取20 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行圖譜采集。

1.3.3 拉曼圖譜數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用LabSpec 5軟件進(jìn)行拉曼數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用（二次函數(shù)）Polynom擬合Baseline的方法，參數(shù)設(shè)為0和1，盡量選擇低階參數(shù)以保證拉曼圖譜的原始形狀基本不改變，且盡量不引入更多的人為因素。由于測(cè)量過(guò)程中，激光點(diǎn)與細(xì)胞距離的差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)的差異，直接影響信號(hào)的收集，使兩個(gè)細(xì)胞拉曼信號(hào)的異同難以明確，因此，假定一定大小激光點(diǎn)內(nèi)測(cè)得的總物質(zhì)量一定、且激光點(diǎn)小于細(xì)胞大小，在此前提下對(duì)經(jīng)Baseline處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行面積歸一化處理。經(jīng)過(guò)初步處理的拉曼圖譜采用均值標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation of the means，SDM）進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，SDM=mean（SD）/SD（mean），SDM值越小表明數(shù)據(jù)越可靠。同時(shí)，選取600～1 800 cm－1范圍生化指紋峰用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析，濾去噪聲，提取拉曼頻帶包含的有用信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將預(yù)處理的數(shù)據(jù)與主成分分析（principle component analysis，PCA）法結(jié)合，PCA中PC個(gè)數(shù)的選擇以能夠解釋數(shù)據(jù)大于70%的變異為標(biāo)準(zhǔn)。