應用拉曼光譜對比分析德氏乳桿菌保加利亞亞種細胞成分（二）
2 結果與分析
2.1 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02正常與VBNC態細胞形態比較
由圖1可知，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態和正常細胞形態差異明顯，VBNC態細胞表面褶皺，長度縮短，但細胞結構仍然完整。該結果與已報道的大腸桿菌VBNC態細胞表現出細胞矮化或尺寸減小的現象類似。
圖1 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的正常和VBNC態表面形態
A.正常細胞（×5 000）；B.正常細胞（×10 000）；C.VBNC態細胞（×5 000）；D.VBNC態細胞（×40 000）。
2.2 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02拉曼譜圖分析
如圖2所示，兩種狀態細胞的拉曼峰強度明顯不同，表明在不同狀態下細胞內各物質間差異較大。
圖2 不同狀態下德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02平均拉曼光譜圖
進一步對拉曼光譜進行PCA，由圖3可知，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02正常細胞和VBNC態細胞之間幾乎無重疊，表明兩種狀態下細菌細胞可以被明顯區分。PC1和PC2的貢獻率分別為72.12%與16.32%，PC1與PC2可解釋約88%的變異信息。兩群體分離差表明，在不同生長階段異質細胞群體差異顯著，通過SCRS可以很好地識別和區分正常和VBNC態細胞。
圖3 不同狀態下德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的拉曼光譜PCA
載荷值是PC分值與原始變量間的相關系數，可以權衡不同變量在PC可變性中所占權重。如圖4所示，PC1載荷絕對值大于0.05所對應的峰具有主要貢獻，表明拉曼峰具有隨時間變化的最大絕對方差，并且對PCA中因子的分離貢獻重大。PC1占數據差異的70%以上，通過對PC1載荷值與相關特征峰強度（特征峰強度反映細胞內某些物質的變化）進行相關性分析，可以得到不同狀態下ND02細胞內相關生物大分子的合成特點。由圖4可知，影響PC1貢獻率的拉曼峰主要為1 673、1 650、1 459、1 030、1 005 cm－1等處的12 個峰。這些峰可作為區分ND02細胞VBNC態和正常態代謝狀態的參數。
圖4 PC1載荷值
2.3 德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態與正常SCRS信號峰歸屬對比
SCRS為所有拉曼光譜成分提供了更詳細的光譜和細胞狀態信息，包括細胞生長過程中核酸、蛋白質和脂質變化，是一種綜合分析的方法。參考文獻得到德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態與正常細胞的主要SCRS信號峰歸屬。12 個特征峰中，830、1 355、1 459、717、813、1 090、1 330 cm－1處的峰與核酸和脂類相關，754、1 005、1 673、1 030、1 650 cm－1處的峰與蛋白相關。結合表1與圖4的PC1載荷值，對比發現ND02 VBNC態和正常細胞間6 個峰強度升高、6 個峰強度下降。其中蛋白類1 005 cm－1峰強度升高，蛋白質類1 030 cm－1和1 650 cm－1峰強度下降；核酸類1 355 cm－1特征峰強度升高；核酸類813 cm－1和1 330 cm－1特征峰強度下降；構成細胞膜重要組分磷脂及類脂的相關物質（717、1 330 cm－1）含量顯著下降；維持細胞內結構蛋白合成的酰胺類物質（酰胺I）含量有上升（1 673 cm－1）也有下降（1 030、1 650 cm－1）。這些均是德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02在4 ℃、低pH值環境壓力下應激反應的結果。
王亞利通過氣相色譜對比分析該菌在4 ℃、低pH值下L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND02 VBNC態和正常細胞的膜脂肪酸含量，結果發現VBNC態細胞與正常細胞相比，不飽和脂肪酸含量由（37.97±0.42）%增加到（53.68±0.15）%。推測L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND02細胞可能通過改變膜脂肪酸的成分和含量、增加不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸比值改變細胞膜流動性，從而更好地適應低溫、低pH值環境，這與本實驗拉曼光譜的脂類分析結果一致。細菌在逆境條件下發生復雜的代謝活動，包括轉錄、翻譯、能量依賴性和酶活性等。低溫會降低細胞內蛋白質尤其是酶的活性，如降低某些蛋白的分泌、部分蛋白質折疊緩慢或效率降低、降低酶進行轉錄或翻譯的活性。
低溫環境使細胞RNA聚合酶活性降低，還可影響核酸的結構和功能；冷脅迫還會促進核糖核酸和脫氧核糖核酸二級結構的穩定，導致核糖核酸翻譯和轉錄效率降低。本實驗拉曼光譜的結果也與王亞利等研究中VBNC態菌株細胞通過減少生命活動，降低能量代謝以及減少營養物質運輸、大分子合成以及呼吸速率的結論一致。本研究結果證實了拉曼光譜可以檢測細菌細胞中各物質水平的變化，提供特定的脫氧核酸、核糖核酸、蛋白質標志，這些物質在細菌細胞中的水平高度依賴細胞的代謝狀態，同時也能夠反映細胞的實時狀態。
3 結論
通過SCRS技術在單細胞水平對德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02 VBNC態和正常細胞內成分進行檢測，并結合PCA多元統計方法進行數據分析，結果表明ND02 VBNC態和正常細胞的拉曼光譜存在明顯差異，主要集中在1 673、1 650、1 459、1 030、1 005 cm－1等處的12 個峰，這些峰主要歸屬于核酸、脂類和蛋白質類。通過掃描電子顯微鏡觀察細菌表征形態變化發現，德氏乳桿菌保加利亞亞種ND02的VBNC態與正常細胞相比變短、變粗，且細胞表面發生褶皺。因此推論細菌在由正常細胞進入VBNC態的過程中可能通過調整遺傳物質、脂類和蛋白質適應不利條件的影響。目前在單細胞水平研究細胞的應激反應方法非常有限，細胞VBNC的機理研究需要多方面技術支持，本研究所用SCRS是一種非標記、不依賴于群體細胞的方法。研究結果證明了SCRS檢測技術應用于乳酸菌VBNC態細胞成分的分析是可行的，該技術在細菌應激、菌株鑒定、確定菌種來源以及選育優良菌株等理論研究及實踐應用中具有廣闊的應用前景。
