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人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析
發(fā)布日期:2023-12-08 09:32:51


人類體細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與核型分析


【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
1. 熟悉人類外周血淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)方法及
染色體 標(biāo)本的制備方法。
2. 熟悉人類染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析。

【實(shí)驗(yàn)原理】
染色體是在顯微鏡下可見細(xì)胞有絲分裂過程中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。因此,必須獲得染色體標(biāo)本才能進(jìn)行檢查分析,通常情況下,都是利用外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行核型分析。正常情況下,人體外周血淋巴細(xì)胞不再分裂,但植物 血凝素(PHA)可刺激血中的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化成淋巴母細(xì)胞,使其恢復(fù)增殖能力。因此,可采取少量外周靜脈血,做短期培養(yǎng),培養(yǎng)至72小時(shí)細(xì)胞進(jìn)入增殖旺盛期,此時(shí)加入秋水仙素抑制細(xì)胞分裂,使細(xì)胞分裂停止在中期以獲得足夠量的分裂期細(xì)胞,經(jīng)低滲、固定、制片、染色后鏡下觀察進(jìn)行核型分析。上述制備的染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶消化、Giemsa染色后,可在染色體縱軸上顯示出著色深、淺相間的橫紋——帶,表明每條染色體的特征。

【實(shí)驗(yàn)用品】
1.采血器材、酒精燈、培養(yǎng)瓶、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、
離心機(jī) 、刻度離心管、乳頭吸管、試管架、量筒、試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機(jī)、托盤天平、顯微鏡、鏡油、二甲苯、擦鏡紙、鑷子、燒杯、記號(hào)筆、玻片架、火柴、10ml注射器。
2.RPMI 1640液體培養(yǎng)基、小牛血清、肝素(500 U/ml)、植物血凝素(PHA)、秋水仙素(10mg/ml)、KCl低滲液(0.075mol/L)、甲醇、冰乙酸、Giemsa原液、磷酸緩沖液(PH6.8)。
3.2.5%胰酶溶液(Hanks液配制)、0.4%酚紅、Giemsa染色液、1N鹽酸、1N氫氧化鈉。

【實(shí)驗(yàn)步驟】
一.外周血淋巴細(xì)胞染色體標(biāo)本制備與分析
1. 采血及接種培養(yǎng)
1.1 在酒精燈火焰上,用滅菌注射器(一次性注射器)抽取肝素0.2ml,使肝素濕潤(rùn)至管壁。
1.2 常規(guī)消毒后,采集外周靜脈血5ml,轉(zhuǎn)動(dòng)注射器使血液與肝素混勻。
1.3 在超凈工作臺(tái)中,預(yù)先將RPMI 1640液體培養(yǎng)基(5ml,含植物血凝素60mg/ml、10%小牛血清)加入消毒好的小培養(yǎng)瓶中,再滴加25滴全血(6號(hào)針頭),水平搖動(dòng)混勻。
1.4 置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)過程中每天水平搖動(dòng)培養(yǎng)物1~2次,使血液均勻懸浮,再繼續(xù)培養(yǎng)。
1.5 終止培養(yǎng)前2~4小時(shí),加入秋水仙素,使終濃度達(dá)到0.2μg/ml。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使秋水仙素混勻。繼續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)。

2.制片
2.1 收集細(xì)胞時(shí),去掉瓶塞,用乳頭吸管吸取培養(yǎng)液,充分混勻培養(yǎng)物,再將全部培養(yǎng)物吸入刻度離心管中。
2.2 1000 rpm離心8分鐘(注意先配平)。
2.3 棄上清液,加入37℃預(yù)溫的 0.075 mol/L KCl溶液8 ml,用吸管輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)混勻后,置37℃恒溫水浴箱低滲處理25分鐘。
2.4 加入 1ml新配制的固定劑(甲醇:冰乙酸=3:1),用吸管小心吹打、混勻,1000rpm離心8分鐘。
2.5 棄上清液,加入8ml固定劑,吹打細(xì)胞團(tuán)制成細(xì)胞懸液后,室溫下固定20分鐘。
2.6 1000 rpm離心 8分鐘。
2.7 棄上清液,重復(fù)固定一次。
2.8 棄上清液,根據(jù)細(xì)胞數(shù)量的多少適當(dāng)加入數(shù)滴新配制的固定劑,吹打細(xì)胞制成懸液。
2.9 吸取少量細(xì)胞懸液,滴2~3滴于冰水浸泡過的載玻片上,吹散,氣干。
2.10 將標(biāo)本置Giemsa染液中,染色8分鐘,水洗去浮色,氣干。
2.11 顯微鏡下觀察染色體標(biāo)本分裂相的多少及分散情況。

二.人外周血淋巴細(xì)胞染色體G顯帶標(biāo)本制備與分析
1. G顯帶染色體標(biāo)本制備
1.1 常規(guī)制片后,將標(biāo)本置70℃烤箱中干烤2小時(shí),自然冷卻。
1.2 取2.5%胰酶溶液5ml,加入染色缸中,加入45 ml生理鹽水,用 1N HCl或1N NaOH及酚紅調(diào)節(jié)胰酶溶液成紫紅色(PH6.8~7.2),置 37℃預(yù)溫。
1.3 將玻片標(biāo)本放入胰酶溶液中處理25~45秒鐘,不斷輕輕搖動(dòng)玻片,使胰酶作用均勻。隨著處理標(biāo)本數(shù)量增加,胰酶逐漸消耗,胰酶作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。
1.4 取出染色體玻片標(biāo)本,置于37℃預(yù)溫的生理鹽水中,然后用蒸餾水沖洗玻片(或輕甩,除去多余的胰酶)。
1.5 將玻片標(biāo)本放入37℃預(yù)溫的Giemsa染液中,染色5~10分鐘。
1.6 自來水沖洗,氣干。
1.7 顯微鏡觀察。

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