ELISA法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

（一） 原理

細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣- 鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA , 產(chǎn)生180bp ～200bp 或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A 、H2B 、H3 和H4 形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA 和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測(cè)細(xì)胞溶解物中的核小體片段。

（二）材料與試劑

1 ．采用Boehringer Mannheim 公司試劑盒，生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗體。

2 ．過(guò)氧化物酶（-POD ）標(biāo)記的小鼠抗DNA 單克隆抗體

3 ．鏈霉親合素包被的微孔板

4 ．DNA －組蛋白復(fù)合物，作為陰性對(duì)照。

5 ．ABTS 底物

6 ．溶解緩沖液

7 ．溫育緩沖液

8 ．底物緩沖液

（三）樣品

 1 ．培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物 細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200μl 溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min 。

2 ．培養(yǎng)細(xì)胞的上清液

3 ．血漿（血清）

（四）操作方法

1 ．取樣品離心后（1 000r/min,10min ）, 吸取20μl 上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。

2 ．另加入80μl 免疫反應(yīng)試劑 含抗－DNA －POD 、抗組蛋白－生物素及溫育緩沖液，室溫下孵育2h （置搖床上，250r/min ）。

3 ．取上清 ，用300μl 溫育緩沖液洗滌3 次，小心移去洗滌液。

4 ．加入100μl 底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合（置搖床上）。

5 ．盡快作比色分析（10min ～20min 內(nèi)），用底物緩沖液作空白對(duì)照，以波長(zhǎng)405nm ，參考波長(zhǎng)492nm 進(jìn)行檢測(cè)。

（五）結(jié)果判定

按下列公式計(jì)算細(xì)胞釋放的單/ 低聚核小體片段的特別聚集值：

注： mU= 吸收值（ 10^-3 ） = 雙孔吸收值的平均 OD 值－底物 OD 值，若樣品的吸 收值超過(guò)比色測(cè)定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)。