MTT 法檢測藥物對貼壁細胞的半抑制濃度

簡介

MTT 又名噻唑藍【3-（4, 5-Dimethyl-2-Thiazolyl）-2, 5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，中文名為 3-（4, 5-二甲基-2-噻唑）-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名為噻唑藍】，是一種黃顏色染料，可用于檢測細胞的存活和生長情況。

原理

活細胞線粒體中（原核細胞則位于細胞膜上）的琥珀酸脫氫酶 （Succinate dehydrogenase） 能夠將外源性 MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜 （Formazan） 并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。

二甲基亞砜 （Dimethyl sulfoxide, DMSO） 能夠溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在 490 nm 波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT 結晶形成的量與活細胞數成正比，可以間接反映活細胞的數量，定量評價供試藥物的毒性。根據檢測數據，計算可得供試藥物對細胞的半抑制濃度。

用途

廣泛應用于藥物對體外培養的細胞毒性的測定。

材料與儀器

（1）實驗器材：

2 mL 離心管、50 mL 離心管

96 孔細胞培養板、10 μL 移液槍

200 μL 移液槍、1000 μL 移液槍

10 μL 槍頭、200 μL 槍頭、1000 μL 槍頭

CO2 細胞培養箱、生物安全柜、離心管架

恒溫震蕩搖床、石英比色皿、酶標儀

光學顯微鏡、多通道移液器（排槍）等

（2）試劑：

MTT、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS

DMSO 等。

（3）供試細胞和待測樣品：

生長于對數期的細胞、待測藥物

步驟

（1）配制 MTT 和梯度濃度的藥物

a. PBS 磷酸緩沖液 （1 L，調節 pH = 7.4）

b. MTT （5 mg/mL）：稱取 MTT 0.5 g，溶于 100 mL PBS 中，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，4 ℃ 避光保存；

c. 待測藥物：稱取約 0.5 mg 待測藥物，用 DMSO 配成 2.56 mg/mL 的初始濃度，建議預實驗稀釋的系列梯度濃度分別為 2.56、1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04、0.02 mg/mL（該濃度范圍針對本實驗室初篩的藥物活性所設，具體藥物濃度請根據自身實際情況進行設立），后根據實驗結果再選擇更精細的濃度；硫酸鏈霉素的濃度與待測藥物一致。

（2）細胞標準曲線制作：

a. 用 0.5% 的胰蛋白酶消化對數期細胞，待細胞即將脫離皿底時，加少量血清終止反應，1000 rpm 離心 5 min，棄上清，將細胞沉淀用培養基吹打混勻，計數后調整細胞懸液的濃度至 5~10×104/mL；

b. 向 96 孔板的小孔中加入 100 μL 細胞懸液，每板鋪 8 組細胞，濃度設置分別為 3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000 個/孔（邊緣孔用無菌 PBS 填充），共鋪 4 板細胞；

c. 96 孔板放入 5% CO2 培養箱中，37 ℃ 培養，每 24 h 取出一塊板進行檢測：

1） 每小孔加入 10 μL MTT溶液，放回培養箱中繼續培養 4~6 h；

2） 吸去小孔內培養液（移液槍不要觸到底部的結晶）， 每孔加入 150 μL DMSO，搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解，之后用酶標儀檢測各小孔在波長 490 nm 下的吸光值；

d. 繪制標準曲線：以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長的標準曲線。

（3）接入細胞：收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度后，向 96 孔板中加入 100 μL 細胞懸液，鋪板使細胞濃度為 1000~10000 個/孔（邊緣孔用無菌 PBS 填充）；

（4）共培養：96 孔板放入 5% CO2 培養箱中，37 ℃ 孵育至細胞貼壁后，加入一系列濃度梯度的藥物，溶劑對照為 DMSO，選擇相應已知活性良好的藥物用作陽性對照，每個處理重復 3 次，繼續培養 24~72 h 后顯微鏡觀察；

（5）向 96 孔板的每個小孔中加入 20 uL MTT 溶液，繼續培養 4 h 后觀察顯色情況，終止培養后，吸去小孔內培養液，每小孔加入 150 uL DMSO，置搖床上低速振蕩 10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀 490 nm 處測量各孔的吸光值。

（6）半抑制濃度采用改良寇式法進行計算，公式：1 g IC50 = Xm - I [P-（3 - Pm - Pn）/ 4]

Xm：1g 最大劑量

I：1g（最大劑量/相臨劑量）

P：陽性反應率之和

Pm：最大陽性反應率

Pn：最小陽性反應率

其中，最大陽性反應率是指最大抑制率，最小陽性反應率是指最小抑制率，藥物抑制率 = 1 - 加藥組 OD 值 / 對照組 OD 值，將所得數據代數計算即可。

注意事項

1）MTT 建議現配現用，分裝后 -20 ℃ 避光保存，若已經變為灰綠色，則不建議繼續使用；

2）要保證初始的鋪板密度一致，需要對細胞進行計數，根據計數結果，調整到鋪板所需密度，本實驗方法中給出的范圍較大，不同細胞需要根據實際情況做出相應調整，同樣地，起始藥物濃度范圍也需進行預實驗判斷；

3）96 孔板最邊緣小孔中的水分蒸發很快，容易導致藥物濃度變化，出現誤差較大，建議邊緣小孔用無菌 PBS 填充；

4）反應結束后需要完全棄去小孔中的液體，本方法中的建議是用移液槍吸取，也可以倒扣 96 孔板用吸水紙吸去液體，兩種方法均須注意不要碰到小孔底的沉淀物。

常見問題

對于未知藥物，加入 MTT 前需確認該藥物是否會與 MTT 反應，或本身具有較強的氧化還原性。如果該藥物成分尚未得到明確鑒定，建議用 PBS 清洗 2~3 次后再補加培養基，之后再加 MTT 溶液。