類器官

簡介

是在體外，經(jīng)過 3D 培養(yǎng)，能夠在體外模擬正常（或疾病）狀態(tài)下體內(nèi)器官（或組織）的三維結(jié)構(gòu)和生理功能。

通俗點(diǎn)講，類器官是三維細(xì)胞培養(yǎng)物，將干細(xì)胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠中，在化學(xué)小分子抑制劑/激活劑、細(xì)胞因子、培養(yǎng)基添加劑等物質(zhì)作用下經(jīng)過培養(yǎng)得到的相應(yīng)器官類似的組織結(jié)構(gòu)。

用途

適用于分子和細(xì)胞生物學(xué)分析，在動物和細(xì)胞水平之間，廣泛應(yīng)用于功能組織誘導(dǎo)、疾病模型建立、藥物篩選、抗炎試驗(yàn)、臨床端研究等多個(gè)方面的研究。

材料與儀器

人多能性干細(xì)胞 ESCs/iPSCs、6 孔板、D-PBS、EDTA、Accutase、培養(yǎng)箱、mTeSR1 培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、離心管、1 ml 移液器、離心機(jī)、臺盼藍(lán)、血細(xì)胞儀或自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、含 50 μM 的 ROCK 抑制劑 Y-27632 的低 bFGF 的 ESCs 培養(yǎng)基、含 Y-7632 的低 FGF-2 的培養(yǎng)基、96 孔板、Y-27632(1:100)、FGF-2、200 μl 移液器、含有 500 μl 的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、含有 500 μl 的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、組織培養(yǎng)顯微鏡、Matrigel 液、Parafilm 膜、剪刀、125 ml 的震動反應(yīng)器、含 Vitamin A 的腦類器官分化培養(yǎng)液

步驟

誘導(dǎo)擬胚體（EB）形成（1~2 h）

1、當(dāng)人多能性干細(xì)胞 ESCs/iPSCs 在 6 孔板中長到融合度為 70~80% 時(shí)用于誘導(dǎo) EB，通常每個(gè)六孔板孔的細(xì)胞可用于誘導(dǎo)一整個(gè) 96 孔板。

對于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)的 ESCs/iPSCs：

① 用 1 ml 的無鈣鎂的 D-PBS 洗滌細(xì)胞后，向每孔中加入 600 μl 的含 0.5 mM 的 EDTA 的無鈣鎂的 D-PBS 溶液。培養(yǎng)箱孵育 4 min；

② 輕柔吸出 EDTA 溶液，注意不要破壞克隆，加入 1 ml 的 Accutase。放回培養(yǎng)箱孵育 4 min；

③ 用 1 ml 的 mTeSR1 培養(yǎng)基吹散克隆，使其從培養(yǎng)皿底部脫落。轉(zhuǎn)移 2 ml 至 15 ml 離心管中，用 1 ml 移液器將克隆吹散為渾濁的單細(xì)胞懸液；

④ 270 g 室溫離心細(xì)胞 5 min，同時(shí)用臺盼藍(lán)檢測死細(xì)胞，用血細(xì)胞儀或自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀細(xì)胞計(jì)數(shù)；檢測兩次取平均值；

⑤ 用 1 ml 的含 50 μM 的 ROCK 抑制劑 Y-27632 的低 bFGF 的 ESCs 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打，保證細(xì)胞呈單細(xì)胞重懸的狀態(tài)。然后，用含 Y-7632 的低 FGF-2 的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為每 150 μl 含 9000 個(gè)活細(xì)胞；

⑥ 每個(gè) 96 孔板孔中放入 150 μl 的細(xì)胞懸液，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

飼養(yǎng) EB，早期胚層分化（5~7 d）

2、24 h 后，顯微鏡下觀察，可見有清晰邊緣的小的 EB 形成，邊緣有許多死細(xì)胞圍繞在 EB 周圍，為正常現(xiàn)象，不會干擾 EB 在中間形成，繼續(xù)置于 37 ℃ 的 5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

3、隔天輕柔地吸去半量培養(yǎng)基，避免干擾到 EB 和底部的細(xì)胞，補(bǔ)充 150 μl 的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加 Y-27632（1：100），F(xiàn)GF-2 濃度為 4 ng/ml，直到 EB 直徑大于 350~450 μm 為止，通常，僅前 4 天需要添加二者；

4、EB 直徑達(dá)到 350~600 μm 時(shí)，用 3 中的培養(yǎng)基隔天飼養(yǎng) EB，培養(yǎng)基中不含 Y-27632 和 FGF-2；

原始神經(jīng)上皮的誘導(dǎo)（4~5 d）

5、EB 直徑達(dá)到 500~600 μm 時(shí)，邊緣開始變得明亮，并且呈現(xiàn)光滑的邊緣（通常為第 6 天），將每個(gè) EB 用剪掉槍頭的 200 μl 移液器轉(zhuǎn)移至含有 500 μl 的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的低吸附 24 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)；

6、轉(zhuǎn)移至 24 孔板后，另外加入 500 μl 的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基飼養(yǎng) EB；

7、2 d 后，組織培養(yǎng)顯微鏡觀察 EBs，形態(tài)邊緣變得更加明亮，提示神經(jīng)外胚層的分化；一旦這些區(qū)域開始顯示與神經(jīng)上皮形成一致的假復(fù)層上皮的放射狀組織，這一般發(fā)生在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的 4~5d 后，繼續(xù)進(jìn)行第 8 步，將神經(jīng)外胚層組織轉(zhuǎn)移至 Matrigel 液滴中（1~2 h）；

8、4 ℃ 下冰上解凍 Matrige；

9、將 Parafilm 膜置于一個(gè)空的帶有凹坑的中號槍頭盒上，將手指按向 Parafilm 膜形成凹坑，每個(gè)坑的體積約為 200 μl；

10、將 Parafilm 膜用剪刀修剪為單個(gè)含 4×4（共 16 個(gè)）凹坑大小的正方形，將其放入 60 mm 的組織培養(yǎng)皿中；

11、用 200 μl 的移液器轉(zhuǎn)移神經(jīng)外胚層組織，每個(gè)凹坑中放置 1 個(gè)；

12、用未剪頭部的 200 μl 移液器小心地吸去組織邊緣多余的培養(yǎng)基；

13、每個(gè)組織快速滴入 Matrigel，每孔約 30 μl，使 Matrigel 滴入 Parafilm 凹坑中；注：快速滴入 Matrigel，避免組織干掉。盡量一次性滴入 Matrigel，一次性包埋好 16 個(gè)組織；

14、用 10 μl 的移液槍頭移動組織，使組織位于液滴的中央，這一步需要在滴入 Matrigel 后立即進(jìn)行，因?yàn)槭覝叵?Matrigel 非常容易固化；

15、將此 60 mm 培養(yǎng)皿置入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中，孵育 20~30 min 以使 Matrigel 聚合；

16、取出 60 mm 培養(yǎng)皿，加入 5 ml 不含 Vitamin A 的腦類器官分化培養(yǎng)基；

17、將 Parafilm 膜反過來并搖動培養(yǎng)皿，直至 Matrigel 液滴從凹坑中滴入培養(yǎng)基中；不容易脫落的液滴可以用鑷子用力晃動 Parafilm 膜使其脫落，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)組織。

神經(jīng)上皮芽的固定培養(yǎng)（4 d）

18、24 h 后，觀察包埋的組織，1~3 d 內(nèi)，組織會呈現(xiàn)包含液體空腔的進(jìn)一步擴(kuò)張的神經(jīng)上皮樣；

19、將液滴繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，然后將培養(yǎng)基更換為不含 Vitamin A 的腦類器官分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h；

腦組織的生長（~1 年）

20、4 h 的靜止培養(yǎng)后，用開口約為 3 mm 的剪去頭部的 1 ml 移液槍頭將包埋好的類器官轉(zhuǎn)移至 125 ml 的震動反應(yīng)器中，加入 75~100 ml 的含 Vitamin A 的腦類器官分化培養(yǎng)液，將此生物反應(yīng)器放置在培養(yǎng)箱中安裝的磁攪拌板或軌道振動篩上用 85 rpm 的速度震動。

21、振動篩上的類器官每 3~4 天全量換液，搖瓶上的類器官每周換液，注意觀察形態(tài)；在合適的時(shí)間點(diǎn)取樣本用于實(shí)驗(yàn)研究；

注意事項(xiàng)

1、干細(xì)胞克隆的形態(tài)對于大腦組織形成的成功與否非常關(guān)鍵。克隆需呈現(xiàn)多能性的特征 （如邊緣清晰，克隆緊密等），且無分化傾向；
2、操作輕柔且不要破壞 EB。
3、將 200 μl 移液器槍頭剪掉時(shí)使開口直徑約為 1~1.5 mm。確保開口不要太小，避免破壞 EB，但也不能太大，太大會難以吸去 EB。不要試圖用刮刀將 EB 鏟出，會破壞 EB 的結(jié)構(gòu)；
4、觀察發(fā)現(xiàn)，500 μl 的 Matrigel 在冰水混合物浴時(shí)，1~2 h 后會恢復(fù)液體狀態(tài)；
5、Parafilm 不能高壓滅菌，所以不能徹底滅菌，因此需保證 Parafilm 膜保存在干凈的環(huán)境中，準(zhǔn)備凹坑前，向手套和 Parafilm 膜噴灑 70% 乙醇消毒；在這一步也可以在培養(yǎng)基中添加抗生素以避免污染；
6、從 Matrigel 主體中會遷移出一些細(xì)胞類型，通常呈成纖維細(xì)胞樣，這些細(xì)胞代表了非神經(jīng)特性的群體，從神經(jīng)誘導(dǎo)時(shí)逃脫出來；然而這些細(xì)胞通常不能生存，且遷移出來后，對神經(jīng)上皮芽的形成呈現(xiàn)促進(jìn)作用；
7、換液時(shí)，傾斜培養(yǎng)皿使液滴下沉，輕柔吸出培養(yǎng)液。盡量在不破壞類器官的情況下，吸出更多的培養(yǎng)液。更換為 5 ml 的新鮮培養(yǎng)液。