一氧化氮合酶組化顯示法

簡介

細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀。

原理

一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本原理是細(xì)胞中的左旋精氨酸和氧在一氧化氮合酶（nitxic oxide synthase，NOS）的作用下生成一氧化氮和瓜氨酸。還原型輔酶II（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，NADPH）是一氧化氮合酶的輔酶，可以將孵育液中的底物脫氫，然后將氫傳遞給硝基四氮唑藍(lán)（NBT），使后者還原成藍(lán)黑色沉淀，此即 NADPH 所在部位，也可代表 NOS 的所在部位。

材料與儀器

器材：

染色缸、載玻片、蓋片、24孔板、毛筆、解剖器材、灌注器材、冰凍切片機(jī)、濕盒、恒溫箱、冰箱、普通光學(xué)顯微鏡、大鼠。

試劑：

①孵育液（NADPH、NBT）

（還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），3 mg ；硝基四氮唑藍(lán)(NBT),2.4 mg ;0.1 mol / L PB(pH 7.4),2 mL ;1%Triton X-100(pH 7.4),1 mL ）;

②0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（PB）

（磷酸二氫鈉（NaH2PO4?2H2O），3 g ；磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O），29 g ；加少量蒸餾水，調(diào) pH 7.2～7.4，最后定容至1000 mL ）;

③1％Triton X-100。

④3％Triton X-100

⑤1％中性紅

⑥梯度乙醇

⑦0.01 mol ／ L PBS

⑧4％多聚甲醛

⑨中性樹膠

步驟

一氧化氮合酶組化顯示實(shí)驗(yàn)的基本過程可分為如下幾步：

（一）腦組織冰凍切片

A．將大鼠常規(guī)灌注固定，取腦組織塊，浸30％蔗糖后行冰凍切片（片厚40 μm ）。

B．將切片浸入0.1 mol ／ L 磷酸緩沖液（0.1 mol ／ L PB，pH 7.2～7.4）中漂洗10 min ，重復(fù)3 次 。

C．1％Triton X-100（用0.1 mol ／ L PB配制，pH7.4）中，室溫，預(yù)浸60 min 。

D．浸入孵育液中孵育，37 ℃ ，3 h 。

E．3％Triton X-100,4 ℃ ，過夜。

F．0.1 mol ／ L PB中漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

G．裱片，風(fēng)干。中性紅復(fù)染。

H．常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

（二）細(xì)胞爬片或甩片

A．細(xì)胞爬片或甩片，0.01 mol ／L PBS漂洗5 min ，重復(fù)3 次 。

B．4％多聚甲醛固定，室溫，30 min 。

C．0.01 mol ／ L PBS漂洗10 min ，重復(fù)3 次 。

D．按上述腦組織冰凍切片步驟（3）～（6）操作。

E．中性紅復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片、觀察。

注意事項(xiàng)

1．冰凍切片采用的是漂浮法，有利于孵育液充分進(jìn)入組織。

2．本方法屬于酶組化，要選擇適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汉颓‘?dāng)?shù)墓潭〞r(shí)間和方法，否則會影響酶的活性。

3．此方法加 Triton X-100 可以改善著色效果，降低非特異性背景染色。但 Triton X-100 預(yù)浸時(shí)間不能超過2 h ，孵育液中 Triton X-100 濃度不能高于2％，否則影響著色效果。孵育液中后加 Triton X-100 ，防止 NBT 難溶。