TRAP檢測法檢測端粒酶活性

簡介

1994，Kim 等人發明了名為端粒酶重復擴增技術（te-lomerase repeat amplification protocol，TRAP）的檢測方法，實現了端粒酶活性檢測的重大突破，并使之成為到目前為止應用得最為廣泛也最為公認的端粒酶活性檢測方法。

原理

TRAP 檢測法檢測端粒酶活性的基本原理是通過具有活性的端粒酶催化，將端粒重復序列（GGTTAG）加到一個寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，然后通過 PCR 擴增 30～33 個循環，通過在反應中的 TS 引物上引入放射性同位素 y-32P-ATP 標記，對 PCR 產物采用聚丙烯酰胺電泳檢測，最后采用放射性自顯影檢測并分析擴增結果。

另外也可以不對引物進行放射性同位素標記，而是采用非放射性的 SYBRGreen 染料對 PCR 產物進行染色鑒定，分析并量化出端粒酶的活性。

材料與儀器

器材：

① 組織研磨器

② 紫外分光光度儀

③ PCR 儀

④ 垂直電泳槽

⑤ 紫外凝膠成像系統

⑥ 待測細胞或組織樣品細胞。

試劑：

① 聚丙烯酰胺凝膠試劑

② Taq DNA 聚合酶;

③ dNTP Mix。

④ SYBR Green 染料

⑤ TRAP 檢測法引物（包括 TS引物，RP引物，K1引物，TSK1引物）;

⑥ 1x CHAPS 緩沖液（10 mmol/L Tris-HCI，pH7.5，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L 苯甲脒，5 mmol/L β-巰基乙醇，0.5％ CHAPS，10％ 丙三醇）

⑦ 10x TRAP 反應緩沖液（200 mmol/L Tris-HCI（pH8.3），15 mmol/L MgCl2，630 mmol/L KCI，0.5% Tween-20，10 mmol/L EGTA）

步驟

TRAP 檢測法檢測端粒酶活性的基本過程可分為如下幾步：

A 細胞或組織的處理，收集細胞，采用 1x CHAPS 緩沖液在冰上勻漿裂解細胞，冷凍離心分離上清液，測定提取上清液的蛋白濃度后，調定模板濃度為固定值，用于下一步檢測。

B TRAP 反應設置，在每個反應中加入模板 2 μl，10x TRAP 反應緩沖液 5 μl，50x dNTP Mix 1 μl，TS引物 1 μl，TRAP 檢測法引物（含 RP引物，K1引物，TSK1引物）1 μl，Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，ddH2O 39.6 μl。

C PCR 擴增，PCR 反應條件為：30 ℃ 孵育 30 min，然后進行兩步 30 個循環，包括 94 ℃ 變性 30 s，59 ℃ 退火／延伸混合 30 s。反應實際是一個共同緩沖液，雙酶系統的反應，在第一個酶系統的反應中，端粒酶將一定數量的端粒重復序列（GGTTAG）轉到了寡核苷酸底物 TS 的 3＇末端，而在第二個酶系統的反應中，TS 和 RP引物則可以擴增出一個以 6 堿基遞增的產物梯度，如從 50 個核酸開始的：50，56，62，68?????片段。

D 反應產物電泳及顯色反應，將 PCR 反應產物上樣到 10％ 聚丙烯酰胺凝膠中，1x TBE 緩沖液電泳，1:10000 SYBR Green 對凝膠進行染色 15 min 后拍攝照片。

注意事項

1 1x CHAPS 緩沖液裂解細胞應在冰上進行，組織樣品比較難于裂解，可能需要用到電動勻漿器，注意應在冰上研磨，避免溫度過高，離心應采用冷凍離心機以防止端粒酶遇熱降解。

2 采用 SYBR Green 染色時間不應過長，染色應避光進行，拍攝時間不應過長，以防熒光染料見光分解，無法獲得清晰圖像。