染色體提前凝集標(biāo)本的制備

簡(jiǎn)介

由于有絲分裂期成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor,MPF)的活性很高，用 M 期細(xì)胞和間期細(xì)胞進(jìn)行融合，可以使間期細(xì)胞出現(xiàn)類似于有絲分裂期的形態(tài)變化:染色質(zhì)凝集、核膜崩解、核仁消失等.這種經(jīng)過誘導(dǎo)而在間期細(xì)胞中形成的染色體稱為提前凝集染色體或早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome,PCC)。

原理

染色體提前凝集標(biāo)本的制備原理是將 M 期細(xì)胞和 G1 期細(xì)胞融合，則 G1 期細(xì)胞染色質(zhì)就凝集為光學(xué)顯微鏡下可見的單股細(xì)而長(zhǎng)的提前凝集染色體，即 G1-PCC。其染色體的長(zhǎng)短和粗細(xì)與細(xì)胞在 G1 期所處的位置緊密相關(guān)：早 G1 期的染色體短而粗，晚 G1 期則細(xì)而長(zhǎng)。S 期細(xì)胞正處于 DNA 復(fù)制階段，大量的復(fù)制單位不同時(shí)啟動(dòng)復(fù)制，所以正在復(fù)制的染色質(zhì)高度解螺旋，光學(xué)顯微鏡下不可見，而只能看到尚未進(jìn)行復(fù)制或復(fù)制后又重新凝集的部分。M 期細(xì)胞誘導(dǎo) S 期細(xì)胞的染色質(zhì)凝集呈粉末狀或粉碎顆粒狀，在電鏡下可見：顆粒狀是染色質(zhì)螺旋化程度高的部位，顆粒之間由纖細(xì)的染色質(zhì)絲相連，并且可根據(jù)顆粒是單股或雙股區(qū)分出是復(fù)制前還是復(fù)制后的染色質(zhì)，從而斷定細(xì)胞是處于早 S 期還是晚 S 期。G2-PCC 的形態(tài)已接近于 M 期的染色體，只是螺旋化程度較低，所以其染色淺、細(xì)長(zhǎng)、姐妹染色單體之間緊靠一起。

用途

染色體提前凝集標(biāo)本常用于細(xì)胞周期分析、正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞染色體的微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究、多種因素作用致染色體損傷及修復(fù)效應(yīng)的研究、血液病的診斷及預(yù)后等臨床實(shí)踐方面。

材料與儀器

器材:

① 普通光學(xué)顯微鏡

② 普通低速離心機(jī)

③ CO2 恒溫培養(yǎng)箱

④ 超凈工作臺(tái)

⑤ 5 ml 刻度離心管、一次性滴管、載玻片、蓋玻片、細(xì)胞計(jì)數(shù)板試劑

材料:

① HeLa 細(xì)胞

② PEG(M, = 4000)(50%)

③ RPMI-1640 培養(yǎng)液

④ 小牛血清

⑤ Hanks 液

⑥ 秋水仙素(10 μg/ml)

⑦ 胰蛋白酶(0.25%)

⑧ KC1(0.075 mol/L)

⑨ 甲醇-冰醋酸(3:1)(新鮮配制)

⑩ 吉姆薩染液

步驟

染色體提前凝集標(biāo)本的制備基本過程可分為如下幾步:

1.M 期細(xì)胞的準(zhǔn)備

(1)按一般方法傳代細(xì)胞。

(2)在培養(yǎng) 2~3 d、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，加入秋水仙素（終濃度為 0.2~0.5 μg/ml），繼續(xù)在 CO2 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3~4 h。

(3)輕輕傾去培養(yǎng)液，用 5 ml Hanks 液清洗細(xì)胞 2 次，棄去死細(xì)胞、細(xì)胞碎片和 Hanks 液。

(4)加入 5 ml Hanks 液，反復(fù)振搖培養(yǎng)瓶 3~5 min，或用吸管反復(fù)輕輕吹打細(xì)胞層。由于 M 期細(xì)胞呈球形，與瓶壁的接觸面積變小，易脫落而懸浮于培養(yǎng)液中。把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移人 5 ml 刻度離心管中，計(jì)數(shù)備用。

2.間期細(xì)胞的準(zhǔn)備

在上述收集過 M 期細(xì)胞的貼壁細(xì)胞中，加入終濃度為 0.25% 的胰蛋白酶溶液，消化 2~3 min，棄去消化液,加入 5 ml Hanks 液，用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞層，把細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移入 5 ml 刻度離心管中，計(jì)數(shù)備用。

3.細(xì)胞融合

(1)將 M 期細(xì)胞和間期細(xì)胞按 1:1 比例（各約 106 個(gè)）混合于 5 ml 離心管中，800 g 離心 5 min，棄上清液。用 5 ml Hanks 液重懸洗滌、離心 2 次，盡可能地棄盡上清液。

(2)輕彈管底使沉淀松動(dòng)，置 37℃（39 ℃ 左右更佳）水浴中預(yù)溫，緩慢逐滴加入 0.5~1 ml 37 ℃ 預(yù)溫的 50% PEG 溶液，邊加邊用吸管輕輕混勻（也可在滴加過程中先輕搖混勻最后再用吸管輕輕吹打混勻）。37 ℃ 靜置 1 min。

(3)加入 5 ml 無血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液（開始 1 ml 應(yīng)緩慢逐滴加入），混勻（稀釋以終止 PEG 溶液的作用）。800 g 離心 5 min（離心前可在 37 ℃ 靜置 5~10 min），棄上清液。

(4)加入含小牛血清的 RPMI-1640 生長(zhǎng)培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻使細(xì)胞懸浮。37 ℃、5% CO2 培養(yǎng) 30~60 min.

4.制片

將上述細(xì)胞取出，800 g 離心 8 min，棄上清液。按常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本。經(jīng)吉姆薩染液染色后觀察結(jié)果。

注意事項(xiàng)

(1)為了保證融合率，加 PEG 之前應(yīng)盡可能地棄盡上清液；在滴加 50%PEG 時(shí)，應(yīng)緩慢、逐滴加入，滴加過程注意要溫和混勻。

(2)在加完 PEG 并靜置 1 min 后，用培養(yǎng)液稀釋 10 倍，手法要輕。在 37 ℃ 培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(30~60 min)，一般可獲得高比例的 PCC。