細胞粘附實驗（MTT 比色法計數）

簡介

體內細胞想要運動要先脫離其他細胞，從而使細胞粘附能力發生改變，細胞粘附實驗主要用于判定細胞在經過各種藥物處理、基因編輯或培養條件改變后，細胞的粘附能力改變情況。

原理

機體內許多細胞，如上皮細胞固定在某處發揮功能；另一些細胞，如白細胞，活躍運動，就需要不斷調節細胞粘附。細胞粘附性的改變在腫瘤轉移過程中也發揮著重要作用。

惡性腫瘤具有從原發瘤分離及在體內擴散的能力，提示這些細胞相互識別及粘附機制發生了改變。將細胞種植于包被的培養板中，培養一段時間后去除未粘附細胞，可以檢測細胞在模擬基質的表面粘附的細胞數變化，通過 MTT 比色法檢測粘附細胞量從而反應粘附的細胞數，即可得出細胞粘附率。

用途

藥物實驗、基因轉染、敲除或培養，腫瘤轉移機制、細胞功能、細胞粘附、炎癥機制等。

材料與儀器

各種規格移液器（0.5~10 μl、10~100 μl、100 μl~1 ml）、各種規格 Tip（10 μl、200 μl、1 ml）、96 孔板、 EP 管、超凈工作臺、二氧化碳培養箱和酶標儀、10 μg/ml fibronectin 纖連蛋白（或 collagen 膠原）、MTT、1% BSA、胰蛋白酶、PBS、FBS、無血清培養基、DMSO 和細胞等。

步驟

1、用預冷的無血清培養基將 fibronectin 配制成 10 μg/ml 的人工基底膜膠液，混勻后置于冰上備用。

2、96 孔板中每孔鋪稀釋過的 fibronectin 50 μl，超凈工作臺中風干過夜。

3、吸去包被液，加入 200 μl 1% BSA 在 37 ℃ 孵育孔板 1 h，用無血清的培養基浸洗孔板 3 次洗去多余的膠備用。

4、待測細胞（包括實驗組和對照組）處理好后，0.25% EDTA 胰蛋白酶消化細胞，用無血清的培養基調整細胞懸液濃度，以 5×104 個/孔接種 96 孔板，每孔體積為 100 μl，同時設不加細胞只加培養液的空白對照孔。每組細胞設置 5 個重復孔，邊緣孔用無菌 PBS 填充。

5、將細胞放入 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養 30~60 分鐘（可根據細胞狀態和實驗需求適當調整培養時間）。

6、取出細胞培養板，吸棄培養基，PBS 輕柔漂洗 3 遍，每孔加入 100 μl 新鮮培養基。

7、96 孔板中每孔加入 10 μl MTT 溶液（5 mg/ml ），37 ℃ 孵育 4 小時。

8、小心吸棄孔內培養上清液，每孔加 150 μl DMSO，搖床振蕩 15 分鐘，使結晶物充分溶解。

9、測定樣品孔 OD 值。選擇 490 nm 波長，用酶標儀測定各孔吸光值，記錄結果。取各重復孔 OD 值的平均數。

10、計算細胞粘附率。

細胞粘附率 = [（實驗組細胞 OD-空白 OD）/（對照組細胞 OD-空白 OD）]× 100%

注意事項

1、MTT 溶液用 PBS 現用現配，0.22 μm 濾器過濾后 4 ℃ 避光保存，兩周內有效，或配制成 5 mg/ml 溶液，于 - 20 ℃ 長期保存。避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或鋁箔紙包住 EP 管避光以免分解。

2、接種細胞過程中，應勻速輕柔滴加至孔中，進行「十」字晃動，保證細胞鋪均勻。

3、用含血清的培養基終止消化，再用無血清培養基洗滌細胞并重懸。