細胞粘附實驗（顯微鏡直接計數）

簡介

細胞粘附性是維持組織結構穩定的基本條件，也是細胞運動和發揮功能的調節因素，通常分細胞與細胞粘附和細胞與基質粘附。

原理

機體內許多細胞，如上皮細胞固定在某處發揮功能；另一些細胞，如白細胞，活躍運動，就需要不斷調節細胞粘附。細胞粘附性的改變在腫瘤轉移過程中也發揮著重要作用。惡性腫瘤具有從原發瘤分離及在體內擴散的能力，提示這些細胞相互識別及粘附機制發生了改變。

用途

藥物實驗、基因轉染、敲除或培養，腫瘤轉移機制

材料與儀器

待檢測細胞、無菌 6 孔培養板、Lipofectamine TM 2000、37LRP siRNA、培養箱、0.25% 胰酶、無血清 MEM 培養基、Matrigel、96 孔板、超凈臺、PBS 或生理鹽水、甲醇、姬姆薩染液、蒸餾水、顯微鏡。

步驟

1、將 4.5×105 個細胞每孔 104 左右傳代于無菌 6 孔培養板中。

2、培養 24 h 后，用 Lipofectamine TM 2000 將 37LRP siRNA 轉染細胞中，轉染后的細胞置 37℃、5％ CO2 培養箱中培養，48 h 后收集細胞。同時各有兩個平行孔的細胞進行陰性對照轉染及未轉染。轉染終濃度即 siRNA 終濃度為 100 nmol/L。?

3、培養 48 h 后收集細胞，用 0.25% 胰酶將貼壁培養細胞（約 1×106 個）從壁上消化下來并制成單細胞懸液。?

4、用無血清 MEM 培養基將 Matrigel 配制成 10 μg / 250 μl（1:300）的人工基底膜膠備用。

5、96 孔板每孔中鋪 Matrigel 2 μg / 50 μl，放于超凈臺中風干過夜。?

6、96 孔板每孔加入適量無血清 MEM 細胞培養液（或 PBS 或生理鹽水），放置 60－90 min，洗去多余的膠。

7、取轉染、陰性對照轉染及未轉染細胞以 4×103 /孔接種在鋪膠的 96 孔板中，設 3 個重復孔，放入 37℃、5％ CO2 培養箱中分別培養 20 min、40 min、60 min。?

8、在相應時間點取出 96 孔板，吸出培養液，用 PBS 洗 3 遍，洗去未粘附細胞。

9、每孔加入 100 μl 甲醇，固定 15 min。

10、每孔加入 100 μl 姬姆薩染液，染色 15 min，蒸餾水洗去染液。

11、顯微鏡下計數粘附細胞數量（每孔在固定位置取 8 個視野）。

注意事項

1、細胞處理需要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。重懸細胞是動作要輕柔，避免多次反復的激烈吹打；

2、染色培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異；

3、染色程度要根據細胞種類而定；

4、加染液時注意盡量不要產生氣泡。