細胞粘附檢測－熒光法

簡介

細胞粘附是指細胞通過細胞表面的特化分子相互作用并附著到鄰近細胞的過程。可分為細胞直接接觸和通過細胞外基質發生連接。

在細胞增殖、維持活性、分化和遷移中具有關鍵作用。細胞黏附熒光法是通過活細胞熒光探針染色黏附的活細胞數量來反應細胞的黏附能力變化。

用途

通過細胞粘附研究可能找到治療癌癥的潛在治療靶點。

材料與儀器

試劑耗材：

① 實驗細胞

② PBS

③ 1% BSA

儀器設備：

① 熒光酶標儀

② 離心機

③ 移液器

④ 冰箱

⑤ 冰盒

⑥ 離心管

⑦ 吸頭

⑧ 鈣黃綠素試劑

步驟

實驗的具體步驟：細胞接種及處理、黏附率檢測。

1、細胞接種

（1）將實驗細胞進行處理，用胰酶消化后，用 PBS 洗滌后，收集到離心管中 1 000 rpm、5 min 并用相應的細胞培養基重懸，制成細胞懸液。

（2）按每孔 5 × 104 細胞接種 96 孔板（具體細胞接種數目依據細胞特性和實驗目的進行調整，檢測前對照組細胞數量達到 80~90%），建議設置 3~5 個復孔。同時設立對照組、藥物處理組、空白對照組。對照組即溶劑處理組，空白對照組為不含細胞且更換正常細胞培養基，其他處理一致。

（3）將細胞放 37 ℃ 培養箱孵育培養 24 h，依照實驗目的分別處理對照組和藥物處理組，后進行熒光染色觀察不同組別熒光強度。

2、粘附率檢測

（1）工作液的配制，從冰箱取出熒光染色（鈣黃綠素）試劑，加入 DMSO 制成儲存液。并按照所測樣品用量加入粘附測定緩沖液制成工作液，儲存液可以 -20 ℃ 下保存。

（2）取出細胞培養板，吸棄培養基。并用 PBS 洗滌 2~3 次后，加入每孔加入 100 μL 鈣黃綠素工作溶液，孵育培養 20~30 min 后，去除上清液后，加入 PBS 清洗細胞。

（3）用熒光酶標儀檢測結果。最大激發波長 488 nm，最大發射波長分別為 520 nm。

（4）細胞粘附率計算。將各測試孔的熒光強度值減去空白孔（未加細胞孔）熒光強度值。各重復孔的熒光強度值取平均數。

細胞粘附率 =（（F 藥物處理細胞 - F 空白）/（F 對照細胞 - F 空白））× 100%

常見問題

（1）離心細胞速度不能太快，還有吹打細胞時動作要輕柔，避免多次反復的激烈吹打，同時不用渦旋振蕩器，減少細胞受損風險。

（2）染色培養時間根據細胞種類的不同和每孔內細胞數量的多少而異。

（3）忘記封閉，或封閉時間較短，使實驗受抗體非特異性結合的影響。

（4）若細胞在染色后于不含染料的培養基中孵育，熒光信號會衰減。

（5）在孵育抗體的時候忘記避光。

（6）鈣黃綠素母液可以進行小量分裝，每次使用一管，試劑于 -20 ℃ 避光凍存，避免反復凍融。

（7）鈣黃綠素工作液要現配現用。

（8）注意洗滌細胞時用 PBS 進行反復洗滌，減少培養基中血清的影響。