細胞侵襲檢測

簡介

惡性腫瘤向鄰近的組織侵犯稱為侵襲。檢測腫瘤侵襲能力是判斷腫瘤轉移能力的一種方法。

原理

Transwell 小室置于 24 孔的培養板中，分為上下室，上室底部為一層聚碳酸酯膜，這層膜具有通透性，將上室培養液和含下室培養液隔開，但是腫瘤細胞可以通過，下室中的培養液（如血清中的趨化因子）可以吸引上室中的細胞。

用途

利用 transwell 侵襲實驗可以檢測腫瘤細胞的侵襲能力。

材料與儀器

① 細胞樣品（細胞狀態好）

② 耗材：EP 管、24 孔板、8 μm 孔徑的 Transwell 小室、冰盒。

③ 試劑：無血清培養基、含 10%~20% FBS 的完全培養基、Matrigen 膠、4％ 多聚甲醛、結晶紫染液。

步驟

1、實驗前準備：

（1）細胞最好在前一天進行饑餓處理（即無血清培養基培養 1 個晚上，增強細胞遷移能力）。

（2）在 4 ℃ 過夜融化 Matrigen 膠，實驗前轉移到冰盒中。

（3）將 tip 頭、EP 管、放有 Transwell 小室的 24 孔板和無血清培養基提前 4 ℃ 預冷，實驗前轉移到冰盒中。

2、基質膠鋪板:

（1）稀釋 Matrigen 膠：先將 8 μL Matrigen 膠加入 64 μL 預冷的無血清培養基（推薦 1:8 的比例稀釋），然后用 tip 頭吹打充分混勻。

（2）均勻鋪膠：吸取 60 μL 稀釋后的 Matrigen 膠，垂直加入 Transwewll 上室中，均勻平鋪在底部。鋪膠過程不要產生氣泡 

（3）凝膠，Matrigen 膠放入培養箱（37 ℃，5% CO2）中孵育 1~3 h 聚合成薄膜

（4）基底膜水化，將上室中多余液體吸掉，在每孔中加入 100 μL 無血清培養基后，于培養箱放置 30 min。

3、收集細胞，離心去上清，用無血清培養基重懸細胞，計數。不同細胞大小和侵襲能力不同，可設置濃度梯度以達到最佳實驗結果。每組細胞的配制：每組 3 復孔。以每孔 105 個細胞/200 μl 的量配制 4 個復孔的用量（多配 1 孔）為例，即 4×105 個細胞/800 μl。

4、transwell 下室加入 700~800 μl 的含 10%~20% 胎牛血清的完全培養基，上室加入（3）中配制好的 200 μl 細胞。

5、細胞培養箱中培養 24~48 小時，具體需要預實驗摸索下，每種細胞侵襲能力不一致。

6、固定。4％ 多聚甲醛室溫 30 分鐘，結晶紫染液室溫染色 30 分鐘，適當風干后，拍照，計數，并進行統計學分析。

注意事項

1、實驗前準備必須要充足，比如 4 ℃ 過夜融化 Matrigen 膠，將 tip 頭、EP 管、放有 Transwell 小室的 24 孔板和無血清培養基提前一晚置于 4 ℃ 預冷。

2、處理 transwell 小室時，動作輕柔，不可暴力吹打。

3、避免產生氣泡。

4、鋪膠一定要均勻

5、有無血清培養基標注清楚，不要用反。

常見問題

1、用棉簽擦上室細胞時，容易蹭到已經穿過去的細胞，要小心操作。

2、將 transwell 小室放入 24 孔板中，接觸面出現氣泡。

3、細胞狀態要好，不然可能不發生遷移

4、細胞接種量的問題，太多太少都會影響實驗結果，建議做個濃度梯度的預實驗。

5、檢測時間點的選擇，也需要進行預實驗。