原代細胞分離培養（小鼠結腸細胞為例）

原理

原代提取目的細胞會混雜著大量的其它細胞，通過不同生物酶的梯度消化、差速貼壁等能夠得到純度較高的目的細胞群。膠原酶是一種從細菌中提取的酶，對膠原消化作用強，適用于纖維組織及上皮組織的消化，其中膠原酶 I 和分散酶 II 消化結腸組織時可以使細胞間質的脯氨酸多肽水解，達到分散細胞，而不影響上皮細胞的效果，采用相差消化法、差速貼壁法去除成纖維細胞可獲得純度較高的結腸上皮細胞。

材料與儀器

含有雙抗的 DMEM 培養基、5 g/L 胰蛋白酶，Buffer 溶液（5% RPMI1640 + 5% FBS + 10mM HEPES），消化液（DMEM 培養基溶解膠原酶 I 濃度為 0.1%，分散酶 II 濃度為 0.3%）

無菌剪刀、無菌鑷子、100 μm 細胞過濾器、細胞培養瓶、細胞培養板；

步驟

（1）C57BL/6 小鼠頸椎脫臼處死，噴適量酒精，滴加適量 Buffer 快速分離結腸；

（2）沿腸系膜剪開，DMEM 培養基清洗去除腸腔內容物；

（3）無菌剪刀將結腸組織剪成 1mm3 左右碎片；

（4）10 mL 0.1% 膠原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化組織，37℃，搖床消化 25 min；

（5）吹打混勻，100 μm 細胞過濾器過濾，收集上清；

（6）相差消化法、差速貼壁法去除成纖維細胞；

（7）加入 1 mL 培養基重懸細胞，接種于培養瓶完全培養基中，37℃，5% CO2 細胞培養箱中培養；

（8）細胞長至培養瓶 80-90% 后用 5 g/L 的胰酶消化液消化，接種于細胞培養板。

常見問題

1. 實驗前所有器械消毒，高壓滅菌，液體無菌過濾；

2. 酶消化液現用現配；

3. 實驗中注意充分消化以保證檢測細胞量足夠；

4. 盡可能充分去除成纖維細胞；

5. 用于后續培養需保證全程無菌操作。