人間充質干細胞無血清培養基的應用及實驗操作步驟
一、背景
人間充質干細胞無血清培養基是一種人間充質干細胞無血清培養基，所述培養基的主要成分包括基礎培養基和添加物。
基礎培養基為a-MEM，L-DMEM，或DMEM-F12中任一種。
添加物包括人血白蛋白(HSA），胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑（ITS），氫化可的松，維生素C（Vc），亞油酸，孕酮，丙酮酸鈉，非必需氨基酸，必需氨基酸，堿性成纖維生長因子（bFGF），轉化生長因子（TGF-β)。
無血清培養基中HSA的添加量為100-1000μg/L，ITS的添加量為1-10ml/L，維生素C的添加量為10-30mg/L，氫化可的松添加量為10-50μg/L，亞油酸的添加量為1-10mg/L，丙酮酸鈉的添加量為50-150mg/L，孕酮的添加量為1-25μg/L，非必需氨基酸的添加量為10-20ml/L，必需氨基酸的添加量為10-20ml/L，bFGF的添加量為1-10μg/L，TGF-β的添加量為1-10μg/L。
傳統培養間充質干細胞的培養基普遍由基礎培養基和胎牛血清（FBS）構成。FBS中含有細胞生長所需的生長因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其他營養物質，可以促進細胞的生長。
但FBS的添加也會產生一些問題或隱患：1）FBS易受病毒，支原體和其他病原體的污染，容易導致干細胞生產過程中發生污染；2）FBS的成分多樣且復雜，目前對其成分、含量及其作用機制仍不清楚，有些可能對干細胞的生長產生抑制或毒害作用；3）FBS都是批量生產，各批次間的質量差異造成干細胞終產品批次間的質量差異；4）FBS中的某些成分難以徹底去除，嚴重影響最終產品質量，具有安全隱患。
二、應用
用于人胚胎干細胞誘導分化為成熟紅細胞的關鍵技術研究：
通過實驗研究解決其中兩個關鍵性技術問題,實現安全低成本的擴增hES細胞和體外無血清培養體系下高效率的擴增紅系祖細胞并向脫核紅細胞分化。希望通過解決以上兩個關鍵技術問題使hES細胞向成熟紅細胞分化能夠更安全、高效,為最終誘導hES細胞分化為成熟紅細胞解決臨床輸血治療面臨的問題奠定實驗基礎。
利用bFGF-hFLSCs作為人源化飼養層細胞體外擴增hES細胞hES細胞建系和常規培養都是用小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)做飼養層細胞或用MEF條件培養基(MEF conditional medium,MEF-CM)添加細胞因子在無飼養層條件下培養hES細胞,這種異基因來源的飼養層給hES細胞的應用帶來很大的安全風險。
為避免動物源性飼養層可能帶來的污染,分離獲得了14周胎齡的人胎肝基質細胞系(human fetal liver stromal cells,hFLSCs),其在體外可以長期培養擴增,能夠傳代35次仍保持正常的核型,形態學及其表面標志表達均類似人間充質干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)。
hFLSCs作為飼養層細胞可以維持hES細胞的增殖傳代達10-15次,hFLSCs飼養層培養的hES細胞經RT-PCR和免疫熒光檢測均表達hES細胞特異性的標志,并保持其干性特征。
免疫熒光結果表明hFLSCs和克隆邊緣分化hES細胞均表達堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的受體成纖維細胞生長因子受體1(fibroblast growth factor receptor1,FGFR1),而未分化hES細胞表達胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor,IGF1R),提示bFGF通過作用于飼養層細胞和克隆邊緣少量分化的細胞來發揮其干性維持的作用。
bFGF是hES細胞體外培養中唯一必需的細胞因子,其在hES細胞的干性維持中發揮著關鍵的作用。
