形態(tài)學(xué)檢測法

原理

根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細胞形態(tài)變化。

材料與儀器

Hela細胞 Jurkat細胞
DAPI Hoechst 蒸餾水 PBS
光學(xué)顯微鏡 倒置顯微鏡 透射電子顯微鏡 熒光顯微鏡 共聚焦激光掃描顯微鏡

步驟

一、光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

1.   未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。

貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

2.   染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割

成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

二、 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258)，DAPI。三種種染料與DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋，終濃度為10 ug/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1 mg/ml的濃度，使用終濃度一般為10 ug/ml。

結(jié)果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。