DNA ladder法

原理

發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸酶被激活，染色體DNA鏈在核小體之間被切割，形成180～200個(gè)堿基或其整數(shù)倍的DNA片段，將這些DNA片段抽提出來(lái)進(jìn)行電泳，可得到DNA梯狀條帶（DNA ladder）。

材料與儀器

凋亡細(xì)胞
蛋白酶K 醋酸鉀 白細(xì)胞裂解液 Tris-HCl NaCl EDTA SDS 乙醇 瓊脂糖
離心管 離心機(jī) 水浴鍋 電泳儀 電泳槽

步驟

一、材料與試劑準(zhǔn)備

1.  材料：凋亡細(xì)胞。

2.  蛋白酶K（500 μg/ml）， 醋酸鉀氯仿（8 mol/L），無(wú)水乙醇，70%乙醇，2%瓊脂糖凝膠。

3.  白細(xì)胞裂解液：pH8.0，10 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L EDTA，1% SDS。

二、操作步驟

1.  收集凋亡細(xì)胞：取1～2×106 個(gè)細(xì)胞，離心后，立即用70%酒精（-20℃）固定2 h。

2.  洗滌：取出酒精固定的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min ，去掉上清液，PBS洗二次。

3.  裂解細(xì)胞：加400 μl細(xì)胞裂解液，充分混勻再加蛋白酶K 100 μl，置65℃水浴消化2小時(shí)或過(guò)夜。

4.  蛋白處理：加75 μl 8 mol/L的醋酸鉀，4℃15 min，再加750 μl氯仿，充分混勻后，10 000 r/min離心10 min后，將上清移至一新的Eppendorf管中。

5.  沉淀DNA：加入750μl無(wú)水乙醇，上下輕柔顛倒混合，即可見乳白色沉淀，若不明顯時(shí)可置-20℃過(guò)夜，12 000 r/min離心10 min，去上清。

6.  洗滌DNA：加1 ml 70%乙醇，混勻，10 000 r/min 離心5 min，去上清。

7.  溶解DNA：根據(jù) DAN 沉淀的大小，加一定量的蒸餾水或TE，37℃溶解。

8.  測(cè)定DNA濃度。

9.  2%瓊脂糖凝膠電泳80 V 2小時(shí)。

三、結(jié)果判斷

出現(xiàn)梯狀電泳條帶，最小的條帶為180～200 bp，其他的條帶為其整倍數(shù)大小。壞死細(xì)胞則出現(xiàn)彌散的電泳條帶，無(wú)清晰可見的條帶。正常細(xì)胞DNA基因條帶因分子量大，遷移距離短，故停留在加樣孔附近。