工具藥、融合蛋白等示蹤自噬形成
原理
正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低,不適于觀察,因此,必須對自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié),包括自噬誘導(dǎo)劑、自噬抑制劑等工具藥,以及反義RNA干擾技術(shù)(Knockdown)、突變株篩選、外源基因?qū)氲取2⑼ㄟ^熒光顯微鏡或者Western Blot等技術(shù)來檢測。
材料與儀器
細(xì)胞
自噬誘導(dǎo)劑 自噬抑制劑 單丹磺酰尸胺(MDC) 0.1%SDS
熒光顯微鏡 細(xì)胞爬片
步驟
一、正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低,不適于觀察,因此,必須對自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)
二、細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后,需對自噬過程進(jìn)行觀察和檢測,常用的策略和技術(shù)有:
1、觀察自噬體的形成;
2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成;
3、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成;
4、檢測長壽蛋白的批量降解;
5、MDC(Monodansylcadaverine,單丹磺酰尸胺)染色;
6、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色,但其能染所有的液泡,故也屬于非特異性的;
注意事項
一、自噬誘導(dǎo)劑
1.Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin :模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
2.Carbamazepine/ L-690,330/ Lithium Chloride(氯化鋰):IMPase 抑制劑(即Inositol monophosphatase,肌醇單磷酸酶)
3.Earle's平衡鹽溶液:制造饑餓
4.N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):Class I PI3K Pathway抑制劑
5.Rapamycin:mTOR抑制劑
6.Xestospongin B/C:IP3R阻滯劑
二、自噬抑制劑
1.3-Methyladenine(3-MA):(Class III PI3K) hVps34 抑制劑
2.Bafilomycin A1:質(zhì)子泵抑制劑
3.Hydroxychloroquine(羥氯喹):Lysosomal lumen alkalizer(溶酶體腔堿化劑)
除了選用上述工具藥外,一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對自噬相關(guān)基因進(jìn)行干預(yù):包括反義RNA干擾技術(shù)(Knockdown)、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/span>
常見問題
在研究自噬相關(guān)蛋白時,需對其進(jìn)行定位。由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切,為了區(qū)別,常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位:
Lamp-2:溶酶體膜蛋白,可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM 探針:有紅或藍(lán)色可選,顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito:載體,轉(zhuǎn)染后表達(dá)一個融合蛋白(紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號),可用來檢測線粒體被自噬掉的程度(Mitophagy)。
MitoTraker探針:特異性顯示活的線粒體,熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60:定位與線粒體基質(zhì),細(xì)胞死亡時不會被釋放。
Calreticulin(鈣網(wǎng)織蛋白):內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔
(注意:這些蛋白均為胞漿蛋白,爬片或胰酶消化的細(xì)胞在做免疫熒光前需先透膜(permeablize),可采用0.1%SDS處理。)