大鼠胰島細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

原理

水合氯醛腹腔麻醉，采用膠原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度離心的方法分離、純化大鼠胰島，并分離、培養(yǎng)胰島單細(xì)胞。 

材料與儀器

一周齡Wistar 大鼠
D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型膠原酶 葡萄糖 碘乙酸
手術(shù)剪 手術(shù)鉗 眼科剪刀 眼科鑷子 大頭針 手術(shù)刀片 培養(yǎng)皿

步驟

1. 一周齡Wistar大鼠，斷頸處死，于75%乙醇浸泡15 分鐘，無菌取出胰腺，于冰冷無菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔細(xì)清除脂肪、包膜、血管等胰外組織，轉(zhuǎn)入青霉素小瓶中。

2. 加入少量無菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片，用滴管輕輕吸出上層細(xì)小脂肪碎塊和油滴，再用無菌D-Hanks’液反復(fù)清洗 8——10 次，加入10 倍體積無菌消化酶液[胰蛋白酶-膠原酶消化液： 0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型膠原酶（663 U/mg），0.05g葡萄糖，溶于100ml無 Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS（pH 值為 7.4）溶液，用0.22 μm 微孔濾膜濾菌]，38℃±1℃消化，消化過程中不斷震蕩，10 分鐘后棄去上清液。

3. 用無菌D-Hanks’液將組織塊清洗 2——3 次，加入新鮮酶液繼續(xù)消化，重復(fù)上述步驟，此時組織塊邊緣模糊。

4. 將組織塊浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分鐘，將消化酶液與組織塊分開，組織塊重新加入新鮮消化酶液進(jìn)行消化；而原消化酶液1500 rpm離心 10 分鐘，取沉淀即為消化下的細(xì)胞，重新用無菌D-Hanks’懸浮，離心，重復(fù) 1——2 次，再用培養(yǎng)基洗 2——3 次，用培養(yǎng)基懸浮即得細(xì)胞懸液。

5. 將消化過的組織塊重復(fù)消化5——6 次至組織塊消化完全，重復(fù)以上操作。

6. 合并幾次所得細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 2×105個細(xì)胞/mL，將細(xì)胞懸液接種于24 孔塑料培養(yǎng)板中，每孔1 ml，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7. 由于成纖維細(xì)胞貼壁要比胰島細(xì)胞迅速，接種15 h 后，輕輕振蕩培養(yǎng)板，將上面未貼壁的細(xì)胞接入新的培養(yǎng)板中，可除去部分成纖維細(xì)胞。

8. 將新培養(yǎng)板中細(xì)胞培養(yǎng) 48 小時后，換新鮮配置的含有2.5 ng/mL 的碘乙酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 h，可除去絕大部分成纖維細(xì)胞，而胰島細(xì)胞不受傷害，換不含碘乙酸的培養(yǎng)基洗2次，并換不含碘乙酸的培養(yǎng)基在 37℃、5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔 3 天換培養(yǎng)液，獲得單層胰島細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

1. 大鼠的胰島提取一般胰尾含有量較多，一般提取時要注意以為部分，充盈良好與否很關(guān)鍵，對于提取量至關(guān)重要。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中，胰酶消化時間不宜過長，否則會影響細(xì)胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 培養(yǎng)基基于4℃條件下可保存3——6個月。