細胞培養技術

原理

直接從生物體內獲取組織細胞進行的首次培養稱為原代細胞培養。原代培養是建立各種細胞系的第一步，是從事培養工作的人員應熟悉和掌握的最基本的技術。根據培養方法不同分為組織塊培養法和單層細胞培養法。

材料與儀器

小鼠
DMEM DMEM 胰酶 PBS
飯盒 紗布 小剪子 小鑷子 大鑷子 大燒杯 平皿 研磨玻片 濾網 離心管 6 孔培養板 吸管 移液管 手套 微量加樣器

步驟

一、實驗步驟

1. 將小鼠斷頸致死，置 75%酒精泡2-3 秒鐘，取肝臟，置于盛有 PBS 的平皿中。

2. 剔除脂肪、結締組織、血液等雜物，轉移到另一個盛有 PBS 液的平皿中。

3. 用手術剪將臟器剪成小塊(大小約 1mm2)，玻片研磨，轉到離心管，離心(1000 rpm，5 min)。

4. 視組織或細胞量加額加入5-6 倍(3-5  ml)胰酶，37℃中消化 20 分鐘，每隔 5 分鐘振蕩一次，或用吸 管吹打一次，使細胞分離。

5. 加入3-5 ml 含血清的培養液以中止胰酶消化作用。

6. 用100 目孔徑濾網濾過，除去未消化的大組織塊。

7. 再次離心5 min，棄上清液。

8. 加入無血清培養液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。

9. 加入含血清的培養液 1-2 ml (視細胞量)，血球計數板計數。

10. 將細胞調整到5x105/ml 左右，轉移至6 孔培養板中，37℃下培養。

注意事項

1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。

2. 在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。

3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細菌落入。

4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。

5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。

6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。

7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理。

8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。

9. 吸溶液的吸管等不能混用。

常見問題

來源《農業生物技術教程》