牛血清培養法

原理

采用視神經，DMEM/F12條件培養基培養，觀察細胞形態及生長，并進行免疫組織化學鑒定。

材料與儀器

Wistar大鼠
亞硒酸鈉 腐胺 轉鐵蛋白 胰島素 甲狀腺素 黃體酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗體
眼科剪 滴管 離心機 培養皿 CO2培養箱

步驟

一、實驗步驟

1.  取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，無菌條件下取出雙側視神經。

2.  接種至24孔培養板內經多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。

3.  加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培養基，37℃，50mL/L CO2，100%濕度連續培養3 d 。

4.  3 d 后棄廢液，改為含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養液繼續培養。

5.  每周換液2次。在獲得足夠的細胞數量后，改用無血清條件培養液繼續培養，每2 d 換液一次。

二、形態學觀察
每天在倒置顯微鏡，觀察培養細胞的生長過程和形態學變化并拍照。
三、免疫細胞化學鑒定

1.  將含細胞蓋玻片取出，0.01 mol·L-1 PBS沖洗3 次x5 min。
2.  冷丙酮固定10 min。
3.  PBS沖洗(3 次x5 min)。
4.  30g·L-1 過氧化氫室溫孵育15 min。
5.  PBS沖洗3 次x5 min。
6.  滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。
7.  滴加1:100 GC抗體，陰性對照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。
8.  PBS沖洗3 次x5 min。
9.  滴加 生物素標記羊抗兔IgG，37℃，20 min。
10.  PBS沖洗3 次x5 min。
11.  滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液。
12.  DAB工作 液顯色，自來水終止反應。
13.  脫水，透明，DPX封片保存。

四、結果

1. 形態學觀察結果

組織塊24 h 開始貼壁，48～72 h 可見神經組織邊緣游出少量細胞，主要為圓形或梭形(圖 1)。8～9 d 左右，細胞基本鋪滿培養孔。此時改用無血清條件培養基培養進行純化。培養過程中，部分細胞死亡。12 d 左右獲得的細胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約 6～10μm。細胞核較大，胞質少(圖 2)。

2. 免疫組織化學染色結果

培養的視神經少突膠質細胞的免疫組織化學染色 GC 蛋白陽性，未加一抗的呈陰性。染色結果顯示成熟的少突膠質細胞突起豐富，互相形成蜘蛛網狀(圖 3)。蘇木素復染，異質細胞較少，90%以上為陽性細胞(圖 4)。

注意事項

1. 體外研究發現甲狀腺素、胰島素、轉鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A 祖細胞朝少突膠質細胞定向分化。

2. 而血清等可以誘導O2A祖細胞分化為Ⅱ型星形膠質細胞。 逐步減少條件培養基中的血清濃度，促進O2A祖細胞向少突膠質細胞分化。