神經膠質細胞培養實驗-胰蛋白酶消化法
材料與儀器
大鼠
CMF-Hanks液 胰蛋白酶 DMEM F12
水浴鍋 培養箱
步驟
一、原代培養
1. 選用生后1周的新生大白鼠，用碘酒,酒精棉球消毒，斷頭取其大腦皮層組織。
2. 解剖顯微鏡下，剝離腦膜，切除大腦髓質部分。
3. 將大腦皮質在無Ca2+、Mg2+Hanks液(CMF-Hanks液)中剪碎。
4. 室溫下靜置10 min。
5. 在37℃水浴箱中用0.125%的胰蛋白酶(用CMF-Hanks液配制)消化30 min。
6. 加入少許含20%血清的DMEM/F12(DMEM與F12為1:1)混合培養液(下同)，用吸管稍加吹打至胰酶液與培養液混勻。離心5 min(1 000 r/min)。
7. 吸去上清含酶液，重新加入含血清培養液，用吸管反復吹打至組織塊消散為止。制成細胞懸液(暫稱初細胞懸液)。
8. 將初細胞懸液接種到玻璃瓶(或培養皿)中，于37℃、5%CO2培養箱中孵育30 min。
9. 翻轉培養瓶,吸出瓶中的細胞懸液。用孔徑為75μm的不銹鋼網過濾。
10. 將濾過液離心10 min(1 000 r/min)，濃縮成約3ml的細胞懸液(暫稱為次細胞懸液)。
11. 將次細胞懸液種植到預先涂布有多聚賴氨酸的培養瓶中。接種的細胞密度約1×104個/cm2。
12. 置CO2培養箱中培養3-5h,再補加足夠的培養液,繼續培養9-14 h。培養液顏色略微變黃時換液。
二、原代培養物的傳代
1. 吸取舊培養液用CMF-Hanks液洗滌2次。
2.加入少許0.125%的胰蛋白液消化15 min。以有血清培養液終止胰酶活性。
3.稍事手動搖晃,倒掉含酶液。加入有血清培養液。
4.用吸管反復吹打使細胞從培養瓶壁脫落。收集細胞懸液,離心10 min(1 000 r/min)。棄上清液，給細胞沉淀物再加入培養液制成細胞懸液。
5.重復原代培養時8-10步。
6.將細胞懸液按0.5×105個/cm2的密度種植在經鼠尾膠原包被的培養瓶中。
7.送入CO2培養箱中培養3-5 h，再加足夠的培養液,繼續培養。
三、結果
分離的大鼠大腦皮質細胞在原代培養4 h后，部分細胞即可長出細小胞突。培養3-4 d之后，細胞數量便明顯增大。大鼠大腦皮質細胞原代培養一般在9-14 d，以星形膠質細胞為主的細胞即可長滿培養瓶壁。
