小鼠腹腔巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

原理

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。

材料與儀器

小鼠
RPMI1640培養(yǎng)基 酚紅 酒精 小牛血清 巰基乙醇酸鈉 雙抗 培養(yǎng)液 小牛血清 青霉素 鏈霉素 臺(tái)盼蘭 碘酒
綿球 手術(shù)直剪 注射器 培養(yǎng)皿 超凈臺(tái) 解剖板 眼科剪 離心管 眼科鑷

步驟

一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備

1.   動(dòng)物：各個(gè)品系的小鼠2-4只。

2.  試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(含酚紅)，小牛血清，雙抗，培養(yǎng)液(10%小牛血清、RPMI1640、雙抗)，臺(tái)盼蘭等。碘酒綿球和酒精綿球。

3.  器械：一次性注射器、手術(shù)器械。

二、實(shí)驗(yàn)方法

如果采用刺激物，則可在實(shí)驗(yàn)前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細(xì)胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開(kāi)始下面的步驟。

1.  拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分鐘，移入超凈臺(tái)中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開(kāi)腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。

2.   用注射器抽取5 mL含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開(kāi)一個(gè)小口，用吸管吸取細(xì)胞懸液，移入離心管中(個(gè)人認(rèn)為，此法比用注射器抽吸好一些)。

3.  1 000 rpm離心5 min后，用含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細(xì)胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)，將細(xì)胞稀釋到目的濃度后，接種即可。

4.  如果是作為飼養(yǎng)細(xì)胞使用，調(diào)整濃度至2x105個(gè)/mL，接種到96孔板中，每孔100-200 uL；如果作為其它實(shí)驗(yàn)使用，可以調(diào)整成2x106/mL，加到24孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO2溫箱孵育2 h后，換液，并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1-2次，棄去未粘附細(xì)胞，貼壁細(xì)胞為單層的巨噬細(xì)胞。

三、 結(jié)果

巨噬細(xì)胞剛貼壁時(shí)偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開(kāi)呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性，當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時(shí)候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，因此，巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。

注意事項(xiàng)

1.  巨噬細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不會(huì)增殖。
2.  很難消化下來(lái)，所以接種的時(shí)候，必須直接接種到目的培養(yǎng)器皿中。

3.  嚴(yán)格無(wú)菌操作，在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。
4.  為避免交叉感染，每一只小鼠更換注射器。
5.  吸管吸取細(xì)胞懸液的時(shí)候，盡量不要吸到大小腸，否則容易引起成纖維細(xì)胞污染。

常見(jiàn)問(wèn)題

巨噬細(xì)胞剛貼壁時(shí)偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開(kāi)呈三角形或多角形。巨噬細(xì)胞有吞噬的特性，當(dāng)與細(xì)菌混合在一起的時(shí)候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌，因此，巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞可以清除部分污染的細(xì)菌、支原體和部分細(xì)胞碎片。