小鼠肝細胞原代培養(yǎng)實驗-胰酶消化法
原理
將小鼠的肝細胞從機體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖。
材料與儀器
小鼠
DMEM 無血清DMEM培養(yǎng)基 胰酶 PBS
飯盒 紗布 剪子 鑷子 燒杯 平皿 研磨玻片 濾網(wǎng) 離心管 6孔培養(yǎng)板 吸管 移液管 手套 微量加樣器
步驟
1. 將小鼠斷頸致死，置75%酒精泡2-3秒鐘，取肝臟，置于盛有PBS的平皿中。
2. 剔除脂肪、結(jié)締組織、血液等雜物，轉(zhuǎn)移到另一個盛有PBS液的平皿中。
3. 用手術(shù)剪將臟器剪成小塊（大小約1mm2），玻片研磨，轉(zhuǎn)到離心管，離心（1 000 rpm，5 min）。
4. 視組織或細胞量加入5-6倍（3-5 ml）胰酶，37℃中消化20分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
5. 加入3-5 ml含血清的培養(yǎng)液以中止胰酶消化作用。
6. 用100目孔徑濾網(wǎng)濾過，除去未消化的大組織塊。
7. 再次離心5 min，棄上清液。
8. 加入無血清培養(yǎng)液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
9. 加入含血清的培養(yǎng)液1-2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù)。
10. 將細胞調(diào)整到5×105/ml左右，轉(zhuǎn)移至6孔培養(yǎng)板中，37℃下培養(yǎng)。
注意事項
1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2. 在超凈臺中，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā)。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞蓋住，以防止細菌落入。
4. 操作前要洗手，進入超凈工作臺后要用75％酒精或0.2％新潔爾滅擦拭手。試劑瓶口也要擦拭。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼。金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，且冷卻后才能夾取組織。吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
7. 不能用手觸及消毒器皿的工作部分，工作臺面上的用品擺放要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。
