腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗-酶消化法
原理
本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇?？捎?.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。
材料與儀器
組織
胰蛋白酶 膠原酶 小牛血清 完全培養(yǎng)基 RPMI-1640培養(yǎng)基
水浴鍋 培養(yǎng)瓶 培養(yǎng)箱
步驟
一、剪碎組織，切成1-2 mm3 小塊中，加入0.25%胰蛋白酶或2 000 U/ml膠原酶。
二、在37℃水浴中消化30min或更長一些，去除消化液，用洗液洗3次，培養(yǎng)基洗1次后，用完全培養(yǎng)基懸浮，并用吸管吹打分散制成細(xì)胞懸液，計數(shù)。
三、以（5-10）x108 個/L細(xì)胞濃度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2 下分瓶（或皿）中培養(yǎng)。
注意事項
一、注意污染
1、嚴(yán)格進行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、嚴(yán)格進行無菌操作，防止細(xì)菌、霉菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。自取材開始，保持所有組織細(xì)胞處于無菌條件。細(xì)胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
3、吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。
4、離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。
5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關(guān)閉工作窗。
6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續(xù)消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細(xì)菌落入。
二、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。
常見問題
一、腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵
腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個方面。在具體培養(yǎng)方法方面，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無原則差別，初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。
1. 要點
（1）取材
人腫瘤細(xì)胞來自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū)，取材時盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進行培養(yǎng)，如因故不能立即培養(yǎng)，可貯存于 4℃中，但不宜栽過 24小時。
2. 培養(yǎng)基
腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對血清的需求比正常細(xì)胞低，正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長，腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基中也能生長。腫瘤細(xì)胞對培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大，是因腫瘤細(xì)胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長物質(zhì)之故。但這并不說明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。按不同細(xì)胞需要不同的生長因子；腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對生長因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長因子。有的還需特異性生長因子〔如乳腺癌細(xì)胞等）?？傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長因子培養(yǎng)更易成功。
3. 成纖維細(xì)胞的排除
成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時混雜生長，致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長得快，最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。
二、成纖維細(xì)胞排除法
1. 機械刮除法
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標(biāo)記：鏡下觀察，用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長腫瘤細(xì)胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養(yǎng)液，把無菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無標(biāo)記空間；
（3）用 Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細(xì)胞；
（4）注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留，可重復(fù)刮除至完全除掉為止。
2. 反復(fù)貼壁法
根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點，并結(jié)合使用不加血清的營養(yǎng)液，把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁，使兩類細(xì)胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細(xì)胞生長達(dá)一定數(shù)量后，倒出舊培養(yǎng)液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗 2次，加入不含血清的培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液；
（2）取編號為此 A、B、C三個培養(yǎng)瓶；首先把懸液接種入 A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng) 5～20分鐘后，輕輕傾斜培養(yǎng)瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液，再接種入 B培養(yǎng)瓶中后；向 A瓶中補充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
（3）培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞 5～20分鐘后，接處理 A的方法，把培養(yǎng)液注入 C培養(yǎng)瓶中；再向 B瓶中補加完全培養(yǎng)基。
當(dāng)三個瓶內(nèi)都含有培養(yǎng)液后，均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功，次日觀察可見 A瓶主要為成纖維細(xì)胞，B瓶兩類細(xì)胞相雜，C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時可反復(fù)處理多次，直至癌細(xì)胞純化為止。
3. 消化排除法
此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng)，具體程序是：
（1）先是用 0.5%胰蛋白酶和 0.02% EDTA（1：1）混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次，然后再換成新的混合液繼續(xù)消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時搖動培養(yǎng)瓶，到半數(shù)細(xì)胞脫落下來后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng)；向原瓶內(nèi)也補加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后，成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過幾次反復(fù)處理，可能把成纖維細(xì)胞除凈。
4. 膠原酶消化法
本法是利用成纖維細(xì)胞對膠原酶較為敏感的特點，通過消化進行選擇。
（1）可用 0.5 mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后，即終止消化；
（2）用 Hanks洗滌處理一次后，更換新培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈，可再次重復(fù)。
