腫瘤細胞原代培養實驗-脫落細胞法
原理
脫落細胞法是指采集人體各部位，特別是管腔器官表面的脫落細胞進行培養。
材料與儀器
腫瘤組織
完全培養基 洗滌液
刀片 培養箱 培養皿
步驟
一、將新鮮的腫瘤組織去除脂肪和結締組織。
二、洗液洗2次后，用刀片將腫瘤組織切成細薄片。
三、在切割的同時有許多上皮細胞脫落下來，脫落細胞經洗滌后，加入完全培養基，便可獲得較純的上層細胞。
四、于培養瓶（或皿）中，37℃、5%CO2 下培養，每隔2-3天換液一次，7-10天上皮細胞逐漸長成單層。
注意事項
一、注意污染
1、嚴格進行動物皮膚消毒，使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2%碘酒液消毒，成年鼠先用3%——5%碘酒液消毒后用75%酒精消毒。
2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質污染。自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
3、吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；吸取液體時，避免瓶口和吸管碰撞。
4、離心管入臺前，管口、管壁應消毒。
5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關閉工作窗。
6、使用過的器械用酒精棉球擦去血污后，移入另一個器皿中繼續消毒，在浸泡器械時剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，并加蓋消毒。凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。
二、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。經火焰消毒后的吸管一定要用Hanks液冷卻。
常見問題
一、組織培養腫瘤細胞生物學特性
腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態、生長增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點：
1. 形態和性狀
培養中癌細胞無光學顯微鏡下特異形態，大多數腫瘤細胞鏡下觀察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動和錨著不依賴性有關。
2. 生長增殖
腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長的因子，而癌細胞在低血清中（2%～5%）仍能生長。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產生促增殖因子能力。正常細胞發生轉化后，出現能在低血清培養基中生長的現象，已成為檢測細胞惡變的一個指標。癌細胞或培養中發生惡性轉化后的單個細胞培養時，形成集落（克隆）的能力比正常細胞強。另外癌細胞增殖數量增多擴展時，接觸抑制消除，細胞能相互重疊向三維空間發展，形成堆積物。
3. 永生性
永生性也稱不死性。在體外培養中表現為細胞可無限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀，體內腫瘤細胞是否如此尚無直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時同樣如此？也尚難肯定。從近年建立細胞系或株的過程說明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應易于培養。事實上，多數腫瘤細胞初代培養時并不那么容易。生長增殖并不旺盛；經過純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現類似二倍體細胞培養中的停滯期。過此階段后才獲得永生性，順利傳代生長下去。從而說明體外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性（包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關性。可能永生性是細胞惡變的階段。至少在體外是如此。
4. 浸潤性
浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長的能力。
5. 異質性分學
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態等性狀不同的細胞組成。異質性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區的細胞獲得血液供應多，增殖旺盛，中心區有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態，那些呈活躍增殖狀態的細胞稱干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長的成分。腫瘤干細胞培養時易于生長增殖；把干細胞分離出來的培養方法稱干細胞培養。
二、體外培養腫瘤細胞生物學檢測
一旦培養的腫瘤細胞生長成形態上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學測定，主要的目的在于求得證明：所培養的細胞系的確來源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學性狀。
測定項目數量無明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點。
1. 形態觀察
主要觀察細胞的一般形態，如大體形態、核漿比例、染色質和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態等。
2. 細胞生長增殖
檢測細胞生長曲線、細胞分裂指數、倍增時間、細胞周期時間。
3. 細胞核型分析
檢測核型特點，染色體數量、標記染色體的有無、帶型等。
4. 凝集試驗
檢測凝集力。
5. 軟瓊脂培養
檢測集落形成能力。
6. 異體動物接種
向異體動物體內（皮下）接種細胞懸液，觀察成瘤能力。
7. 其它
除上述項目外，根據需要還可做同位素標記、組織化學成分分析，熒光顯微鏡觀察等。
在上述腫瘤細胞生物學檢測中，最主要的為：異體動物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀察等幾項。當然從分子細胞學角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測。
