呼吸道感染病毒標本的直接檢測

簡介

通過顯微鏡觀察、或者檢測病毒的抗原和核酸，可以直接顯示病毒的存在。直接檢測病毒的方法包括電鏡觀察病毒顆粒、光鏡下觀察病毒感染后宿主細胞的特殊改變、免疫熒光檢測、酶免疫技術以及病毒核酸檢測技術。

材料與儀器

器材：

①一次性無菌手套
②標本采集管
③棉簽拭子
④電子顯微鏡
⑤微孔板條
⑥酶標儀
⑦PCR儀

試劑：

①材料：待采標本
②PBS緩沖液
③瓊脂

步驟

呼吸道感染病毒標本的直接檢測的基本步驟可分為如下幾種：

（一）顯微鏡觀察

通過在光學顯微鏡下觀察病毒引起的細胞病變，如觀察RSV感染形成的合胞體，或者通過熒光抗體染色后，觀察熒光陽性細胞，顯示病毒的存在。電子顯微鏡偶爾用來確定標本中呼吸道病毒。通過形態學和與特異性免疫血清的反應初步識別。然而，由于該檢測需要專業設備、經驗豐富人員和較高的試驗成本，以及檢測的靈敏度較低，已很少用于呼吸道感染病毒的診斷。

（二）免疫熒光技術

免疫熒光技術（immunofluorescence assay，IFA）是在熒光顯微鏡下觀察細胞內病毒抗原及存在的位置，從而顯示病毒的存在，為呼吸道病毒的快速診斷方法之一。應用免疫熒光法檢測標本中細胞內的病毒抗原，可在數小時內獲得結果，但易產生非特異性染色。檢測的方法包括直接免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗兩種。可用免疫熒光技術直接檢查呼吸道脫落上皮細胞內病毒特異抗原，呼吸道病毒特異抗原以及病毒培養物中的抗原。

（三）酶免疫技術及其衍生技術

1．檢測病毒抗原 酶免疫技術中ELISA由于需要較長的反應時間和幾次洗滌過程，只能在實驗室中使用，如用ELISA定性檢測血清或血漿標本中SARS-CoV N抗原，用于SARS-CoV感染的早期輔助診斷。

目前國內可以供應的商品化呼吸道病毒ELISA 檢測試劑盒主要用于甲型、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒的檢測。基于酶免疫技術發展起來的免疫層析技術（膠體金層析），可在30分鐘獲得結果，在呼吸道感染病毒的快速篩查中應用更廣，現有多種檢測流感病毒、呼吸道合胞病毒的試劑盒。這些快速檢測方法的靈敏度范圍為60％到90％不等。

2．檢測病毒抗體 常用ELISA方法檢測，檢測的抗體可包括IgG、IgM、IgA或總抗體。一般同時檢測急性期和恢復期雙份血清，效價升高≥4倍具有診斷意義。

（四）病毒核酸檢測技術

幾乎所有已知的呼吸道感染RNA病毒都能用單重RT-PCR進行檢測。由于呼吸道感染病毒種類多，核酸檢測傾向于多目標技術，包括多重 RT-PCR、基因芯片技術等，實時熒光定量PCR以及反轉錄PCR技術在診斷新發傳染病以及病毒培養較為困難的病毒毒株時具有非常重要的價值，除商業化銷售的試劑盒之外，上級疾病控制部門還可能根據實際需要下發針對特定新發傳染病病原體的檢測試劑盒。

例如流感大流行期間下發的新甲型H1N1亞型流感病毒檢測試劑盒，SARS冠狀病毒檢測試劑盒以及中東呼吸合征冠狀病毒檢測試劑盒等。