病毒的分離和鑒定
簡介
雖然動物接種、雞胚培養、器官培養（如氣管軟骨環）和細胞培養均可用于呼吸道感染病毒的分離和培養，但幾乎所有病毒實驗室采用細胞培養來培養呼吸道病毒，而雞胚培養在疫苗生產中使用更多，實驗室檢測已很少用。
材料與儀器
器材：
①一次性無菌手套
②培養箱
③離心機
試劑：
①材料：待采標本
②PBS緩沖液
③培養基
步驟
病毒分離和鑒定根據病毒種類不同，其基本步驟可分為如下幾種：
（一）病毒的分離
1. 細胞系的選擇 不同呼吸道病毒，應選擇其敏感的細胞系／株進行培養。為了使所培養的細胞能適應多種病毒的分離培養，可通過建立混合培養細胞系，如結合水貂肺細胞（MV-1-Lu）和人腺癌細胞（A549）的R-mix細胞系可用于A型和B型流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒和腺病毒的分離培養。
2．特殊的培養條件
（1）流感病毒：該病毒穿入宿主細胞的前提是其血凝素被胰蛋白酶或者胰酶樣酶切割，傳代細胞MDCK不會產生這類酶，因此，為了幫助流感病毒進入MDCK細胞，需要在培養液中加低濃度胰蛋白酶。另外培養液中的小牛血清會滅活胰蛋白酶，因此細胞接種病毒標本前，應用無血清培養液或其他平衡鹽溶液洗細胞。
（2）冠狀病毒：不同冠狀病毒，選擇不同細胞系進行培養（表6-6）。值得注意的是培養冠狀病毒的溫度稍低，為33～35℃。
3．細胞病變特征
（1）流感病毒：引起MDCK細胞的病變特征是細胞腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或破裂，嚴重時細胞部分或全部脫落。
（2）副流感病毒：不同副流感病毒，其細胞病變的特征有差異，如感染hPIV-1的細胞變小而圓；感染hPIV-2的細胞，易出現細胞融合現象；感染hPIV-3的細胞，易出現橋狀結構；感染hPIV-4的細胞，易出現整個單層細胞的改變，細胞腫脹圓化，間隙增大，甚至脫落。
（3）呼吸道合胞病毒：細胞病變的特征是細胞變圓，并發生細胞融合現象。
（4）人偏肺病毒：細胞病變效應在接種后3～23天出現（平均17.3天），大部分病變特征為出現小的、圓的、有顆粒的折射性細胞，偶見合胞體病變。
（5）冠狀病毒：SARS-CoV引起的細胞病變明顯，細胞變圓、脫落。MERS-CoV引起的細胞病變在酸性條件下表現為細胞融合，在中性或弱堿性條件下表現為細胞變圓和脫落。HCoV-229E、OC43和NL63的病變輕微，細胞呈絲狀、顆粒增多、變圓，散在于細胞層上，細胞很少完全破壞。
（6）腺病毒：細胞病變的特點是細胞先變圓，進而成球形，折光性增強，許多病變的細胞聚集成一串串葡萄狀。
（二）病毒鑒定與分型
1．免疫學方法 包括經典的中和試驗、血凝抑制試驗，以及現在仍廣泛使用的各種免疫標記技術。該類檢測方法的前提是具有病毒相應的抗體，如用針對流感病毒核蛋白或呼吸道合胞病毒融合蛋白的抗體，確定是否為相應病毒，再用特異性抗血清分型或確定特異性抗原類型。
2．基于核酸檢測的方法
（1）反轉錄PCR：越來越多用于病毒的鑒定和分型，可有幾種形式：
①實時熒光RT-PCR，使用不同引物和探針，根據是否出現特異性擴增產物進行分型和鑒定。
②常規RT-PCR，使用一條共同引物和互補的分型引物組合，擴增后電泳，根據擴增產物片段的大小，區分不同型別的病毒，如呼吸道合胞病毒G蛋白基因在不同的亞型間高度變異的特點，設計3個引物，P1、P2和P3。
P1根據G蛋白基因5＇端核苷酸的序列設計，該區域A、B亞型間核酸序列高度保守，為A、B亞型的通用引物，P2和P3分別位于核苷酸的3＇端，分別與A亞型和B亞型互補，如果是A亞型，P2和P1共同擴增出277bp的片段，如果是B亞型，則P3與P1擴增出863bp的片段，PCR產物在瓊脂糖凝膠中進行電泳，根據條帶的大小，就可以判定A、B亞型。
（2）序列測定：通過序列比對進行鑒定和分型，以及根據系統進化樹，研究不同病毒的親緣關系，隨著測序技術的發展，成本降低，該技術將被更廣泛應用。
注意事項
（1）標本毒性反應鑒別與處置：如果在接種標本1～2天內細胞迅速出現老化，這可能是由于標本中含有毒性物質導致的非特異毒性反應，解決的辦法是：①將這些接種標本的細胞于-20℃凍融，釋放存在的病毒（此為病毒第二代），取0.2ml接種到新的單層細胞上；②如果又出現毒性反應，應該取原始標本用PBS稀釋，再次接種到同種細胞中。
（2）污染與對策：細菌污染易造成培養液渾濁或細胞死亡，使感染細胞無法出現細胞病變效應（CPE），或者真菌污染，培養液變酸，細胞無法正常生長，應重新取原始標本接種細胞，并考慮標本是否除菌處理不當，或者操作污染，或者培養液中抗生素濃度不夠／失效。支原體污染，細胞形態無明顯改變，培養液也不混濁，但細胞的生長特性、細胞膜組成或染色體會出現異常，因此應定期檢測細胞是否被支原體污染，一旦被污染，需丟掉被污染的細胞。
（3）避免病毒交叉污染：在傾倒已接種病毒的細胞培養液時，應該用移液管移走液體，每一步都要更換新移液管，避免劇烈震動而產生氣溶膠等。
（4）盲傳：培養7～10天后仍無細胞病變時，或者其他技術也未顯示培養物中有相應病毒的存在，也將培養細胞收獲，再接種細胞，盲傳3代后，仍無細胞病變，或者其他檢測均陰性時，可認為病毒分離陰性。
