肝炎病毒的病毒分離與鑒定

簡(jiǎn)介

肝炎病毒是指一組主要侵犯肝臟引起病毒性肝炎的病原體，其中有些也可引起腦、肺和心臟的損害。病原學(xué)來(lái)源不同的肝炎其實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)差異較大，病原學(xué)診斷主要涉及甲、乙、丙、丁、戊五型，包括各種肝炎病毒的核酸定性及定量，抗原組分及抗體等三個(gè)層次的檢測(cè)，檢查的目的是明確肝炎病因及病毒核酸復(fù)制的情況，以協(xié)助臨床診斷和治療、流行病學(xué)調(diào)查以及環(huán)境監(jiān)測(cè)。

原理

目以 HAV 和 HBV 感染為例，HAV 感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括三個(gè)方面：① 在潛伏期或急性期檢查糞便中的甲型肝炎病毒抗原，因?yàn)榱可偾页掷m(xù)時(shí)間短，實(shí)際很少應(yīng)用；② 檢測(cè)發(fā)病早期和恢復(fù)期雙份血清中的抗 HAV 抗體；③ 檢測(cè)單份血清中抗 HAV IgM 抗體，以區(qū)別急性感染與既往感染。

HBV 感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括四個(gè)方面：生物化學(xué)檢測(cè)，HBV 血清標(biāo)志物檢測(cè)、HBV 分子生物學(xué)診斷以及 HBV 臨床藥物療效檢測(cè)。HBV 病原學(xué)診斷主要依據(jù) HBV 血清標(biāo)志物作出判斷，包括病毒的抗原抗體及病毒的核酸兩方面。

肝炎病毒體外培養(yǎng)十分困難。盡管 HBV 可以在健康成人或人胚胎干細(xì)胞中生長(zhǎng)，這一培養(yǎng)系統(tǒng)不能用于感染性病毒顆粒的增殖。因此，該系統(tǒng)不能用于實(shí)驗(yàn)室的診斷檢測(cè)。HCV 病毒培養(yǎng)還處于研究階段。肝炎病毒的細(xì)胞培養(yǎng)模型應(yīng)用性不強(qiáng)，而且因?yàn)椴《就L(zhǎng)緩慢，目前僅用于實(shí)驗(yàn)室研究。

材料與儀器

器材：黑猩猩、土撥鼠、北京鴨

步驟

（一）病毒分離培養(yǎng)

目前動(dòng)物模型主要用于肝炎病毒的病原學(xué)研究、疫苗免疫效果評(píng)價(jià)及藥物篩選等。

1，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 HAV 的主要自然宿主為人類(lèi)及靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。黑猩猩、獼猴、狹猴、恒河猴等均對(duì) HAV 易感，我國(guó)學(xué)者毛江森等還最早建立了短尾猴 HAV 感染動(dòng)物模型。口服或靜脈注射病毒均可使這些動(dòng)物感染 HAV，并有肝炎癥狀的表現(xiàn)，糞便中出現(xiàn)完整的有感染性的病毒顆粒，同時(shí)被感染動(dòng)物血液中可查出抗 HAV 的抗體。

對(duì) HBV 敏感的動(dòng)物有樹(shù)頤以及黑猩猩、長(zhǎng)臂猿和絨毛猴等高等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，其中黑猩猩是研究 HBV 的最佳動(dòng)物模型，但由于道德，經(jīng)濟(jì)及飼養(yǎng)操作不方便等原因，使高等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型的使用受到了限制。人 HBV 感染樹(shù)嗣出現(xiàn)各種臨床表現(xiàn)和病毒復(fù)制的特征，肝細(xì)胞可出現(xiàn)病毒復(fù)制并分泌 HBsAg 和 HBeAg，并可發(fā)展肝細(xì)胞癌。嗜肝 DNA 病毒科的其他成員如鴨乙型肝炎病毒（duck hepatitis B virus，DHBV），土撥鼠肝炎病毒（ wood chuck hepatitisvirus， WHV）及地松鼠肝炎病毒（ground squirrel hepatitis virus ，GSHV）等可在其相應(yīng)的天然宿主中形成類(lèi)似人類(lèi)乙型肝炎的感染，因此可用這些動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。家鴨有很高的 DHBV 感染率，已廣泛用作嗜肝 DNA 病毒的動(dòng)物模型，我國(guó)常用 DHBV 感染模型進(jìn)行抗病毒藥物篩選以及免疫耐受機(jī)制的研究；WHV 在宿主土撥鼠體內(nèi)引起的病毒生物學(xué)效應(yīng)與 HBV 類(lèi)似，因而土撥鼠是適于進(jìn)行病毒復(fù)制。細(xì)胞感染及癌變機(jī)制，抗病毒治療等研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。另外， HBsAg 和 HBeAg 轉(zhuǎn)基因小鼠是用 HBsAg 和 HBeAg 編碼相應(yīng)基因制備的轉(zhuǎn)基因小鼠，可為研究 HBV 疫苗及肝細(xì)胞癌的病毒性起源提供手段。HCV 最理想的動(dòng)物模型是黑猩猩，病毒可在其體內(nèi)連續(xù)傳代，但癥狀較輕。對(duì) HDV 敏感的動(dòng)物有黑猩猩、土撥鼠和北京鴨，可作為 HDV 研究的動(dòng)物模型。黑猩猩對(duì) HEV 也很敏感。

2．細(xì)胞培養(yǎng) HAV 可在多種原代及傳代細(xì)胞中增殖，包括原代械猴肝細(xì)胞、傳代恒河猴胚腎細(xì)胞（FRhk4、FRhk6）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、人成纖維細(xì)胞（2BS）、人胚肺二倍體細(xì)胞（MRC5 或 KMB17）及人肝癌細(xì)胞（PLC/PRF/S）等。1979 年 Provost 首次利用傳代恒河猴腎細(xì)胞（FRhk6）成功培養(yǎng)出 HAV。在 HAV 感染的潛伏期末期和急性期早期，可以采取咽拭子或糞便上清液接種敏感細(xì)胞進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)和鑒定。目前用于 HAV 分離培養(yǎng)的細(xì)胞株主要有 FRhk4 和 2BS，HAV 在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖速度非常緩慢且不引起細(xì)胞病變，病毒經(jīng)若干代培養(yǎng)后，可逐漸適應(yīng)細(xì)胞，但仍需 20 天才能收獲到最大量病毒。因此，從臨床標(biāo)本中分離 HAV 常需數(shù)周甚至數(shù)月，并且需要用免疫學(xué)方法檢測(cè)病毒的抗原成分才能確定是否有病毒在細(xì)胞中增殖。

HBV 體外細(xì)胞分離培養(yǎng)尚未成功，目前主要采用全基因組，1.2 倍體或 1.3 倍體 HBV DNA 轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞進(jìn)行 HBV 擴(kuò)增，被轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞可表達(dá)所有的 HBV 抗原并可進(jìn)行病毒復(fù)制。目前應(yīng)用較多的人肝癌細(xì)胞系有 PIC/PRF/5 細(xì)胞系、Hep3B 細(xì)胞系。HepG2 細(xì)胞系、HepG2.2.15 細(xì)胞系。所獲得的體系主要用于 HBV 感染機(jī)制和藥物療效評(píng)價(jià)等研究，檢驗(yàn)價(jià)值不高。HCV 體外復(fù)制細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng) JFH-1/HCVec 由 2 a 型 HCV RNA（JFH-1 株）構(gòu)建而成，能自我復(fù)制并具感染性。HDV 的基因克隆和表達(dá)在原核細(xì)胞及真核細(xì)胞也已獲成功，但 HEV 體外細(xì)胞培養(yǎng)困難，迄今仍不能在細(xì)胞中大量培養(yǎng)。

（二）病毒的鑒定與分型

1. 免疫電鏡檢查﹐經(jīng)消化道傳播的病毒性肝炎可采用免疫電鏡檢測(cè)患者潛伏期末期和急性期早期糞便、膽汁的 HAV 和 HEV 顆粒，還可用 RIA 或 ELISA 法檢測(cè)肝組織中的相應(yīng)病毒抗原。但這些方法操作較復(fù)雜，需特殊設(shè)備和技術(shù)，且由于病毒在肝組織。膽汁和糞便中存在時(shí)間往往較短，陽(yáng)性率較低，不宜作為常規(guī)檢查。

檢測(cè)方法：將含 HAV 或 HEV 的細(xì)胞提取液 10 000 r/min 離心 30 分鐘，取上清，然后 38 000 r/min 離心 4 小時(shí)，沉淀重懸加 1:20 稀釋的抗 HAV 特異血清，37 ℃中和 1 小時(shí)，28 ℃過(guò)夜，2500 r/min 離心 2 小時(shí)，沉淀重懸后滴網(wǎng)，磷鎢酸負(fù)染后鏡檢。結(jié)果判定：可觀察到成堆實(shí)心和空心顆粒，顆粒間有抗體橋形成，根據(jù)顆粒的直徑大小，判斷 HAV 或 HEV 的感染。

2. 中和試驗(yàn)﹑中和試驗(yàn)可用于 HAV 分離株的鑒定。試驗(yàn)方法：用已知含 320~1 000 log TCID50/ml 病毒懸液與等量的 1:10 稀釋的抗 HAV 特異血清混合，37 ℃中和 1 小時(shí)，接種單層細(xì)胞，培養(yǎng) 28~32 天收樣，抽提病毒液，用酶標(biāo)法檢測(cè) HAV 抗原。同時(shí)用 HAV 抗體陰性血清作對(duì)照，并設(shè)不加血清的病毒對(duì)照。結(jié)果判定：若分離株能被抗 HAV 血清中和，HAV 抗原檢測(cè)為陰性，而抗 HAV 陰性血清對(duì)照和病毒對(duì)照結(jié)果一致，表明分離株為 HAV。

3. 基于核酸檢測(cè)的方法

（1）HAV RNA 的檢測(cè)：HAV 核酸檢測(cè)應(yīng)用 cDNA-RNA 核酸雜交技術(shù)及 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中 HAV RNA。PCR 引物主要是依據(jù) 5'NCR 中的保守序列設(shè)計(jì)合成。利用 RT-PCR 檢測(cè) HAV RNA，敏感，快速，一般 4~12 小時(shí)即可得出結(jié)果，可以早期診斷 HAV，以便采取有效預(yù)防措施，盡早隔離傳染源，在防止甲肝流行方面有著重要意義。

由于 HAV-cDNA 克隆成功，應(yīng)用分子雜交技術(shù)檢測(cè)感染細(xì)胞和患者糞便中的 HAVRNA，用 P 標(biāo)記 HAV-cDNA 片段作探針，與載體上被檢標(biāo)本中的 HAV RNA 雜交，可用于 HAV RNA 的檢測(cè)。

對(duì)于牡蠣等貝類(lèi)產(chǎn)品中富集的 HAV 可使用硅膠膜柱法提取 RNA，然后進(jìn)行 RT-PCR，并結(jié)合 Southern 雜交法進(jìn)行 HAV 檢測(cè)和鑒定。

（2）HBV DNA 的檢測(cè)

1）用于 HBV DNA 檢測(cè)的 PCR 主要有巢式 PCR，半巢式 PCR，多重 PCR、原位 PCR 及近年發(fā)展的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 等。這些類(lèi)型的 PCR 靈敏度和特異性高，可用于檢測(cè)無(wú)血清學(xué)標(biāo)志甚至常規(guī) PCR 檢查陰性的 HBV 感染者。但由于檢測(cè)條件要求較嚴(yán)格，應(yīng)在具備條件的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)需要選用。PCR 檢測(cè) HBV DNA 是一種敏感度很高的方法，因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中控制污染是檢測(cè)中的重要問(wèn)題，應(yīng)予以足夠重視。

2）核酸雜交檢測(cè) HBV DNA 的方法有斑點(diǎn)雜交法、原位雜交法，核酸印跡雜交法等。① 斑點(diǎn)雜交法：本法簡(jiǎn)便。微量，特異性和敏感性均較高，已被廣泛用作藥物療效考核和人群篩檢，適用于大量標(biāo)本的檢測(cè)。② 核酸印跡雜交法：即用標(biāo)記探針與經(jīng)瓊脂糖電泳分離并轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的標(biāo)本進(jìn)行雜交的方法。如檢測(cè) HBV 的 DNA 雜交法，該法較斑點(diǎn)雜交法敏感度高，可將特異性 DNA 片段集中于一條區(qū)帶上，起到濃縮和純化作用，可檢測(cè)肝組織等樣本中的 HBV DNA，特異性高。結(jié)果判定：雜交帶的分子量在 3.2kb 的，為游離型 HBVDNA；大于 3.2kb 者為整合型 HBV DNA。若出現(xiàn)許多彌散狀小于 3.2kb 的雜交帶，可認(rèn)為 HBV DNA 為復(fù)制狀態(tài)；出現(xiàn)單一或幾個(gè)大于 3.2kb 的雜交帶，證明為非復(fù)制型。對(duì)同一標(biāo)本，整合型與非整合型、復(fù)制型與非復(fù)制型的 DNA 可同時(shí)存在。③ 原位雜交法：具有高度的敏感性和特異性，而且由于不經(jīng)核酸提取，其特異核酸不會(huì)因稀釋而導(dǎo)致陰性結(jié)果，更重要的是該法能在不破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的情況下精細(xì)地對(duì)待測(cè) HBV DNA 進(jìn)行定位和定量。肝組織的原位雜交可在冰凍切片或石蠟切片上進(jìn)行，切片經(jīng)一定處理后再與探針雜交，后顯影觀察結(jié)果。結(jié)果判定：在細(xì)胞核、胞質(zhì)、胞膜及細(xì)胞間隙出現(xiàn)顆粒狀顯色者為 HBV DNA 陽(yáng)性。

4） HBV 基因分型檢測(cè)：常用 HBV 基因分型方法如下：① 序列測(cè)定法：最直接，可信度高，但煩瑣費(fèi)時(shí)而且價(jià)格昂貴，對(duì)混合型感染檢測(cè)能力差，不適于大樣本檢測(cè)。② 聚合酶鏈反應(yīng) - 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）：較測(cè)序法簡(jiǎn)便，適于大樣本檢測(cè)，但由于需要進(jìn)行酶切，所以操作仍較為煩瑣，成本較高，并存在酶切不徹底等問(wèn)題。③ PreS2 單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定（mAbs EIA 法）：簡(jiǎn)單，快速，已商品化，適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高，并不能有效鑒別有些混合型感染和 HBsAg 低表達(dá)及某些表位表達(dá)不充分的標(biāo)本。④ 分子探針雜交法：簡(jiǎn)單，快速，對(duì)混合型檢測(cè)非常敏感，目前已經(jīng)商品化。適于大樣本檢測(cè)，但檢測(cè)費(fèi)用較高而且靈敏度和特異度還有待提高。⑤ 型特異性引物 PCR 法：簡(jiǎn)單，快速，成本低，具有較高的靈敏度，適于流行病學(xué)研究和臨床大樣本檢測(cè)，但特異性還有待提高。

（3 ）HCV RNA 的檢測(cè)：主要包括 HCV RNA 檢測(cè)和基因分型。

1） HCV RNA 檢測(cè)：檢測(cè)肝組織內(nèi) HCV RNA 可采用原位斑點(diǎn)核酸雜交法，而血清中 HCV RNA 含量較低，多采用較靈敏的熒光 PCR 和 PCR-ELISA 方法，PCR 引物多選用最保守的 5'NCR 序列。熒光定量 PCR 儀定量檢測(cè)標(biāo)本中的 RNA 拷貝數(shù)，可對(duì)丙型肝炎患者干擾素治療的療效進(jìn)行評(píng)估。

患者感染 HCV 后 1~3 周，外周血清中即可檢測(cè)出 HCV RNA，HCV RNA 出現(xiàn)早于 HCV 抗體，HCV RNA 持續(xù) 6 個(gè)月以上陽(yáng)性即為慢性感染。

2） HCV 的基因分型：基因分型對(duì)于丙型肝炎流行病學(xué)的研究具有重要作用，同時(shí)有助于對(duì)治療應(yīng)答情況的預(yù)測(cè)和療程的優(yōu)化。目前對(duì) HCV 的基因分型可通過(guò)核苷酸測(cè)序分析、PCR-RFLP 和型特異探針雜交等方法對(duì) HCV 5'NCR 和其相鄰的核心區(qū)進(jìn)行分析。PCR 檢測(cè)也用于評(píng)價(jià)和分析 HCV RNA 基因變異的程度。5'NCR 的分析主要用于型的鑒別，核心區(qū)的分析主要用于亞型的鑒別。HCV 核心區(qū)同源率若大于 94% ，為同一亞型；介于 89% 和 94% e 之間為同一型的不同亞型；同源率小于 89% 為不同型。

（4）HDV RNA 的檢測(cè)：HDV RNA 檢測(cè)主要通過(guò)斑點(diǎn)雜交和 PCR 法進(jìn)行。

（5）HEV RNA 的檢測(cè)：應(yīng)用 RT-PCR 可在患者暴露于病原后第 3~7 周時(shí)血清中查到 HEV RNA 的存在，也可檢測(cè)糞便或膽汁中的 HEV RNA，有助于確診戊型肝炎。

注意事項(xiàng)

① HBV DNA 檢測(cè)可了解 HBV 的復(fù)制狀況，作為確診病情的主要依據(jù)。如 HBV DNA 測(cè)定值>1 000 copies/ml，提示 HBV 有復(fù)制，而且病毒 DNA 拷貝數(shù)的高低與病毒復(fù)制的程度成正相關(guān)。拷貝數(shù)越高，提示病毒復(fù)制越活躍，傳染性越強(qiáng)；若結(jié)果陰性，則表明病毒處于不活躍階段，病情比較平穩(wěn)。

② HBV DNA 是目前判斷乙肝抗病毒藥物用藥指征及判斷藥物療效最敏感的指標(biāo)。乙肝抗病毒治療的標(biāo)準(zhǔn)就是 HBV DNA>1 000 copies/ml，且患者轉(zhuǎn)氨酶超過(guò)正常值兩倍，此時(shí)是肝病患者抗病毒治療的最佳時(shí)機(jī)。HBVDNA 陽(yáng)性者，即使肝功能正常，必要時(shí)也應(yīng)考慮進(jìn)行抗病毒治療。HBV DNA 檢查結(jié)果還可以在一定程度上輔助判斷 HBV 是否產(chǎn)生了變異，如在治療過(guò)程中 HBV DNA 檢測(cè)結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性時(shí)，提示病毒已發(fā)生變異，應(yīng)結(jié)合具體病情重新選擇抗病毒藥物。