出血熱病毒分離、鑒定和診斷方法

簡介

出血熱病毒分離、鑒定和診斷方法包括病毒分離、電子顯微鏡、檢測抗原、檢測病毒特異性抗體和核酸檢測。其中分離到病毒是診斷各種出血熱的“最高境界”，尤其是對那些未知的傳染病。絕大部分出血熱患者在入院時處于病毒血癥期，有利于病毒分離。

材料與儀器

器材：

電子顯微鏡等。

試劑：

① ELISA試劑盒

步驟

出血熱病毒分離、鑒定和診斷的基本過程可分為如下幾步：

（一）病毒分離

A 細(xì)胞培養(yǎng)

① 絕大部分出血熱患者在入院時處于病毒血癥期，有利于病毒分離。患者的樣品（血清或研碎組織）應(yīng)該做系列稀釋，然后接種細(xì)胞。

② 接種后的細(xì)胞要每天觀察病變，定期用 IFA 和 ELISA 檢測病毒抗原，用 RT-PCR 檢測病毒 RNA。

③ 感染 1 周后，如果細(xì)胞培養(yǎng)病毒陰性，把細(xì)胞培養(yǎng)液上清盲傳 1~2 代，每代用免疫熒光法或 RT-PCR 檢測病毒。

B 動物接種

在沒有細(xì)培養(yǎng)條件時，可以用患者血液或組織接種動物。各種病毒的宿主不同，實驗動物也有區(qū)別。

① 漢坦病毒具有多宿主性，每一個血清型的漢坦病毒都有各自的宿主動物，哺乳動物、鳥類、爬行動物和兩棲動物大約 200 種動物可以感染漢坦病毒，但具有流行病學(xué)意義的宿主動物和傳染源主要是嚙齒動物。易感動物有多種，如黑線姬鼠、長爪沙鼠、小白鼠、大白鼠等，但除了小白鼠、乳鼠感染后可發(fā)病及致死外，其余均無明顯癥狀，實驗室中常人工感染小白鼠，特別是對其乳鼠進(jìn)行腦內(nèi)接種漢坦病毒，增加病毒的毒力。鼠類是辛諾柏病毒的宿主，不同鼠種攜帶病毒的血清型 / 基因型不同，包括鹿鼠、棉鼠、白足鼠和其他鼠種。

新疆出血熱病毒用于初代病毒分離的動物以出生后 24~48 小時內(nèi)乳鼠最佳，每份標(biāo)本接種 1 窩小鼠。敏感的鼠種包括瑞士種或昆明種的小白鼠。初代分離以腦內(nèi)和腹腔接種為好，接種后觀察 2~3 周。初代分離時，有時癥狀不典型或沒有癥狀，需要傳 2~3 代后才能有典型發(fā)病。病毒鑒定可用 ELISA、免疫熒光法、RT-PCR 和序列分析。

② 絲狀病毒的最佳動物模型是獼猴，其在吸入或注射病毒后出現(xiàn)的感染癥狀與人十分接近。在猴子模型中，絲狀病毒的毒力有相當(dāng)大的可變性，這與人類對病毒感染的差異性相似。在埃博拉病毒中，扎伊爾種的毒力最強(qiáng)，Reston 種的毒力最弱。猴子感染馬爾堡病毒后也能存活，其毒力與埃博拉病毒蘇丹種相當(dāng)。其他猴子以及豚鼠也是非常好的實驗?zāi)Ｐ汀Ｒ延邪２├《荆ㄔ翣柗N）的小鼠模型，用于細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)研究，但是小鼠模型與人類感染情況相差較遠(yuǎn)，從這些研究中獲得的實驗數(shù)據(jù)不能直接應(yīng)用到人身上。

③ MACV 和 JUNV 病毒最常用的動物是新生鼠或田鼠，沙粒病毒也可以用小的豚鼠，一般 7~18 天引起死亡。豚鼠也可用于絲狀病毒的分離培養(yǎng)，但絲狀病毒初代培養(yǎng)只引起豚鼠發(fā)熱，傳代后才引起死亡。小鼠對 ZEBOV 敏感，但對其他絲狀病毒不敏感。乳鼠是分離 CCHFV 的經(jīng)典動物。

（二）電子顯微鏡

電子顯微鏡可以用來觀察病毒的超微結(jié)構(gòu)，絲狀病毒科是感染人類的唯一絲狀病毒，所以電鏡可以直接將其與其他病毒區(qū)分。絲狀病毒感染的患者的抗凝血液、尿液和組織均可用電子顯微鏡觀察到病毒。沙粒病毒細(xì)胞培養(yǎng)樣品呈沙粒狀，電鏡下也可與其他病毒區(qū)分。但電子顯微鏡觀察不能作為鑒定病毒的方法。

（三）檢測抗原

A 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測（ELISA）病毒抗原 ELISA 是診斷各種出血熱的敏感和特異的方法，可以用來檢測 γ-射線照射過的或經(jīng) β- 丙內(nèi)酯（β-propionolactone）滅活過的血清、組織培養(yǎng)上清液、尿液、咽喉清洗液。酶標(biāo)板用抗體包被，檢測患者血清中的病毒抗原，第二抗體采用標(biāo)記的多抗比單抗更敏感。如果樣品的 A410 超出陰性對照 A410“均數(shù)＋3 倍標(biāo)準(zhǔn)差” 可判定為陽性。檢測的敏感度一般為（1.3~3.2）x 10 PFU/ml。

B 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）免疫組織化學(xué)染色經(jīng)常用來檢測沙粒病毒和絲狀病毒。甲醛固定的組織經(jīng)過切片固定到硅烷（silane）包被的玻片上，再經(jīng)過脫蠟、與抗體和抗抗體反應(yīng)后進(jìn)行病毒的檢測。IHC 對于檢測皮膚等組織中的絲狀病毒非常有效。

（四）檢測病毒特異性抗體

A 間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）間接免疫熒光法是檢測患者血液中病毒抗體的常用方法，可以用來檢測所有出血熱病毒感染。IFA 簡單，但結(jié)果判定比較主觀，另外大部分出血熱病毒沒有商業(yè)化的抗原片，所以越來越被 ELISA 所取代。患者血清需要從 1:4 或 1:8 開始，對倍稀釋。陽性是指在 1:64 或更高稀釋度的血清能夠出現(xiàn)清晰典型熒光。

B 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）隨著商品化的 ELISA 試劑盒的應(yīng)用，ELISA 已被廣泛用于檢測各種出血熱病毒感染。ELISA 可以分別檢測 IgM 和 IgG 抗體。IgM 陽性說明患者有近期感染。如果樣品的 A410 超出 “陰性對照 A410 均數(shù)＋3 倍標(biāo)準(zhǔn)差” 可判定為陽性。在我國腎病綜合征出血熱和發(fā)熱伴血小板減少綜合征均有 ELISA 抗體檢測試劑盒。在國外，沙粒病毒的 LASV、JUNV 和 MACV，還有 CCHFV 的抗體均可用 ELISA 檢測。因為 NP 是出血熱病毒的主要抗原，所以腎病綜合征出血熱、發(fā)熱伴血小板減少綜合征、CCHFV 和 LASV 的 ELISA 試劑盒都用 NP 的重組蛋白作為 ELISA 試劑盒的抗原。

C 空斑減少中和試驗（plaque-reduction neutralization tests，PNRT） 空斑減少中和試驗檢測血清中中和抗體。中和抗體與病毒結(jié)合可以阻止病毒與受體結(jié)合，阻止病毒被細(xì)胞吞噬，或阻止病毒脫殼。有包膜的病毒與中和抗體結(jié)合后激活補(bǔ)體，可以使病毒裂解。通過這些效應(yīng)，中和抗體能夠阻止病毒感染細(xì)胞，使病毒的感染率下降。人血清中中和抗體的產(chǎn)生需要幾個星期，一旦產(chǎn)生中和抗體可以持續(xù)幾年。空斑減少中和試驗既可以用于檢測患者血清中抗體的消長情況，也可用來鑒定未知病毒或?qū)Σ《具M(jìn)行半定量。檢測抗體時，一般稀釋含有中和抗體的血清，檢測病毒時，一般需稀釋病毒。血清稀釋液中需要含有補(bǔ)體，因此常在稀釋液中加入 10％的豚鼠血清作為補(bǔ)體來源，然后把中和抗體與待檢測病毒混合，再感染細(xì)胞，觀察空斑數(shù)量。中和抗體的滴度用中和指數(shù)表示。

（五）核酸檢測

A 反轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）RT-PCR 方法簡單、敏感、特異，可以對滅活的病毒進(jìn)行檢測，特別適用于無法進(jìn)行病毒分離的標(biāo)本。現(xiàn)在 RNA 提取和 RT-PCR 都用試劑盒，所以 RT-PCR 非常方便。RNA 抽提液一般含有硫氰酸胍（guanidinium thiocyanate），其足以滅活各種出血熱病毒，但做 RNA 抽提要在生物安全柜中進(jìn)行。

每種病毒的 RT-PCR 都有特異引物，這些引物往往選自于同一種病毒比較保守的區(qū)域。單純用一對引物 RT-PCR 陽性作為診斷某個病毒感染是不夠的，需要有病毒分離或血清學(xué)陽性的證據(jù)。如果沒有病毒分離或血清學(xué)證據(jù)，至少要用擴(kuò)增不同部位的第 2 對引物證實病毒感染。RT-PCR 的靈敏度為檢測 10RNA 模板/ml，實時 RT-PCR 比 RT-PCR 的靈敏度高，能夠檢測到 1500~3000 個病毒 RNA 模板/ml。

B 原位雜交（in situ hybridization）用與病毒 RNA 序列匹配的探針與活檢的組織樣品中的 RNA 雜交可以檢測埃博拉和克里米亞 - 剛果出血熱，但其他病毒未見報道。