動物病毒的雞胚培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
原理
本實(shí)驗(yàn)用痘苗病毒和雞新城疫病毒接種雞胚。痘苗病毒適宜于在絨毛尿囊膜上生長，經(jīng)培養(yǎng)后，產(chǎn)生肉眼可見的白色痘皰樣病變，似小結(jié)節(jié)或白色小片云翳狀。雞新城疫病毒適宜接種在尿囊腔和羊膜腔內(nèi)，生長后，雞胚全身皮膚出現(xiàn)出血點(diǎn)，以腦后最顯著。
材料與儀器
痘苗病毒（Vavvinia virus） 雞新城疫病毒（Newcaatle distase virus） 白殼受精卵
2.5％ 碘酒 70％ 乙醇
孵卵器 檢卵燈 齒鉆 磨殼器 鋼針 蛋座木架 注射器 鑷子 剪刀 封蠟 滅菌培養(yǎng)皿 滅菌蓋玻片
步驟
1. 準(zhǔn)備蛋胚
孵育前的雞卵先用清水以布洗凈，再用干布擦干，放入孵卵器內(nèi)進(jìn)行孵育（37℃，相對濕度是 45～60％），孵育 3 d 后，雞卵每日翻動 1～2 次。孵至第 4 d，用檢卵燈觀察雞胚發(fā)育情況，未受精卵，只見模糊的卵黃黑影，不見雞胚的形跡，這種雞卵應(yīng)淘汰。活胚可看到清晰的血管和雞胚的暗影，比較大一些的可以看見胚動，隨后每日觀察一次，將胚動呆滯或沒有運(yùn)動的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或?qū)⑺赖碾u胚，要隨時加以淘汰。生長良好的蛋胚一直孵育到接種前，具體胚齡視所擬培養(yǎng)的病毒種類和接種途徑而定。
2. 接種
2.1 絨毛尿囊膜接種
2.1.1 將孵育 10～12 d 的蛋胚放在檢卵燈上，用鉛筆勾出氣室與胚胎略近氣室端的絨毛尿囊膜發(fā)育得好的地方。
2.1.2 用碘酒消毒氣室頂端與絨毛尿囊膜記號處，并用磨殼器或齒鉆在記號處的卵殼上磨開一三角形或正方形（每邊約 5～6 mm）的小窗，不可弄破下面的殼膜。在氣室頂端鉆一小孔。
2.1.3 用小鑷子輕輕揭去所開小窗處的卵殼，露出殼下的殼膜，在殼膜上滴一滴生理鹽水，用針尖小心地劃破殼膜，但注意切勿傷及緊貼在下面的絨毛尿囊膜，此時生理鹽水自破口處流至絨毛屑囊膜，以利兩膜分離。
2.1.4 用針尖刺破氣室小孔處的殼膜，再用橡皮乳頭吸出氣室內(nèi)的空氣，使絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室（圖 1）。
絨毛尿囊膜接種法A. 接種前的準(zhǔn)備；B. 接種后雞卵的狀態(tài)
2.1.5 用注射器通過窗口的殼膜窗孔滴 0.05～0.1 ml 痘苗病毒液于絨毛尿囊膜上。
2.1.6 在卵殼的窗口周圍涂上半凝固的石蠟，作成堤狀，立即蓋上消毒蓋玻片。也可用揭下的卵殼封口，則將卵殼蓋上，接縫處涂以石蠟，但石蠟不能過熱，以免流入卵內(nèi)。將雞卵始終保持人工氣室在上方的位置進(jìn)行 37℃ 培養(yǎng)，48～96 h 觀察結(jié)果。
溫度對痘苗病毒等病灶的形成影響顯著，應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度在 37℃，高于 40℃ 的培養(yǎng)溫度，雞胚不能產(chǎn)生典型病灶。
2.2 尿囊腔接種
用孵育 10～12 d 的蛋胚，因這時尿囊液積存得最多。
2.2.1 將蛋胚在檢卵燈上照視，用鉛筆畫出氣室與胚胎位置，并在絨毛尿囊膜血管較少的地方作記號。
2.2.2 將蛋胚豎放在蛋座木架上，鈍端向上。用碘酒消毒氣室蛋殼，并用鋼針在記號處鉆一小孔。
2.2.3 用帶 18 mm 長針頭的 1 ml 注射器吸取雞新城疫病毒液，針頭刺入孔內(nèi)，經(jīng)絨毛尿囊膜入尿囊腔，注入 0.1 ml 病毒液。
尿囊腔接種
2.2.4 用石蠟封孔后于 37℃ 孵卵器孵育 72 小時。
2.3 羊膜腔接種
2.3.1 將孵育 10～11 d 的蛋胚照視，畫出氣室范圍，并在胚胎最靠近卵殼的一側(cè)做記號。
2.3.2 用碘酒消毒氣室部位的蛋殼。用齒鉆在氣室頂端磨一三角形，每邊約 1 cm 的裂痕。
2.3.3 用滅菌鑷子揭去蛋殼和殼膜，并滴加滅菌液體石蠟一滴于下層殼膜上，使其透明，以便觀察，若將蛋胚放在檢卵燈上，則看得更清楚。
2.3.4 用滅菌尖頭鑷子，兩頁井?dāng)n，刺穿下層殼膜和絨毛尿囊膜沒有血管的地方，并夾住羊膜從剛才穿孔處拉出來（圖 3）。
圖 3 羊膜腔接種
２3.5 左手用另一把無齒鑷子夾住拉出的羊膜，右手持帶有 26 號針頭的注射器，刺入羊膜腔內(nèi)，注入雞新城疫病毒液 0.1 ml。針頭最好用無斜削尖端的鈍頭，以免刺傷胚胎。
2.3.6 用絨毛尿囊膜接種法的封閉方法將卵殼的小窗封住，于 37℃ 孵卵器內(nèi)孵育 48～72 小時，保持蛋胚的鈍端朝上。
雞胚接種病毒的操作過程及使用器械應(yīng)嚴(yán)格無菌，盡可能在無菌工作臺上進(jìn)行。
3. 收獲
3.1 絨毛尿囊膜
3.1.1 用碘酒消毒人工氣室上的卵殼，去除窗孔上的蓋子。
3.1.2 將滅菌剪子插入窗內(nèi)，沿人工氣室的界限剪去殼膜，露出絨毛尿囊膜，再用滅菌眼科鑷子將膜正中夾起，用剪刀沿人工氣室邊緣將膜剪下，放入加有滅菌生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)，觀察病灶形狀。然后或用于傳代，或用 50％ 甘油保存。
3.2 尿囊腔接種法收獲尿囊液
3.2.1 將蛋胚放在冰箱內(nèi)冷凍半日或一夜，使血管收縮，以便得到無胎血的純尿囊液。
3.2.2 用碘酒消毒氣室處的卵殼，并用滅菌剪刀除去氣室的卵殼。切開殼膜及其下面的絨毛尿囊膜，翻開到卵殼邊上。
3.2.3 將雞卵傾向一側(cè)，用滅菌吸管吸出尿囊液。一個蛋胚約可收獲 6 ml 左右尿囊液，收獲的尿囊液暫貯 4℃ 冰箱，經(jīng)無菌試驗(yàn)合格后于 -30℃ 長期貯存。
3.2.4 觀察雞胚，看有無典型的癥狀。
3.3 羊膜腔接種法收獲羊水
3.3.1 按收獲尿囊液的方法消毒、去殼，翻開殼膜和尿囊膜。
3.3.2 先吸出尿囊液。
3.3.3 再用鑷子夾出羊膜，以尖頭毛細(xì)吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入滅菌試管內(nèi)，每蛋胚可吸 0.5～1.0 ml。經(jīng)無菌試驗(yàn)后，保存于低溫中。
3.3.4 觀察雞胚的癥狀。
