細菌的接合作用實驗

原理

本實驗采用的供體菌是大腸桿菌野生型 Hfr 菌株，對鏈霉素呈敏感性（Str3），受體菌為大腸桿菌營養塊陷型突變體 （Thr-Leu-Thi-），需要蘇氨酸，亮氨酸和硫胺素，對鏈霉索呈抗性 （Str3）。短期接合配對以后，在含有鏈霉素和硫胺素的基本培養基上只能分離到蘇氨酸和亮氨酸的重組子 （Thr＋Leu+Thi-），硫胺素標記位于轉移染色體的末端，在短期配對過程中因配對中斷難以轉移到受體細胞， 因此硫胺素是 Thr＋Leu+Thi- 重組子的必須生長因子。

材料與儀器

大腸桿菌
LB 液體培養基 鏈霉素硫胺素基本固體培養基平板
無菌試管 1 ml 無菌吸管 盛有 70％ 乙醇的燒杯 玻璃涂拌 振蕩混合器

步驟

1. 分別將供體菌和受體菌接種在 2 支盛有 5 ml LB 液的試管中。37℃ 振蕩培養 12 h。

2. 分別用不同的 1 ml 無菌吸管吸取 0.3 ml 供體菌培養液和 1 ml 受體菌培養液至同一無菌試管中。

受體菌是過量的，這樣可以保證毎一個供休菌有相同的機會和受體菌接。

3. 用兩只手掌輕輕搓轉試管，使試管內供、受體菌混勻。

動作要輕柔，使供體菌和受體菌充分接觸，同時避免剛接觸的配對又被分開。

4. 將供、受體菌混合培養物置 37℃ 保溫 30 min。

5. 3 個鏈霉索硫胺素固體培養基平板，冷凝后，用玻璃記號筆分別作好標記，2 個平板分別用于供體菌和受體菌作為對照，第 3 個平板用于供、受體菌混合培養物。

6. 吸取 0.1 ml 供體菌放到一個作好標記的對照平板上，用無菌的玻璃涂棒將平板上的供體菌液涂布到整個平板表面，同樣吸取 0.1 ml 受體菌涂布到另一個作好標記的對照平板上。

7. 供、受體菌混合培養物保溫 30 min 后，將這支試管劇烈振蕩。

動作要劇烈，可用振蕩混合器振蕩幾秒鐘，使供休菌和受體菌之間的性菌毛斷開，從而中止基因的遣傳轉移。

8. 吸取 0.1 ml 混合培養物，如上述方法涂布到作好標記的平板上。

9. 將所有的平板倒置于 37℃ 培養 48 h。