DNA 濃度和純度的測(cè)定

原理

溴化乙錠（EB）是一種嵌入型染料，其上的一個(gè)菲啶環(huán)可插入到 DNA 或 RNA 鏈的堆積堿基之間。溴化乙錠的嵌入基團(tuán)與堿基的接近使二者緊密結(jié)合。

DNA 吸收 254 nm 的紫外輻射并傳遞能量給 EB，而 EB 本身在 302 nm 和 366 nm 處有光吸收。吸收的能量在 590 nm 處釋放，并表現(xiàn)為橙紅色熒光。結(jié)合的EB的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于游離 EB 的熒光產(chǎn)率。

EB 結(jié)合量的多少與 DNA 的大小和構(gòu)型有關(guān)，而熒光強(qiáng)度正比于嵌入溴化乙錠的量。對(duì)于單一構(gòu)型的同種 DNA 樣品來說，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的 DNA 含量成正比。

材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn) DNA 樣品（已知濃度的線性化 DNA，以 TAE 稀釋為梯度濃度的一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品）

質(zhì)粒 DNA 的酶切樣品（待測(cè)）

溴化乙錠 EB 5 μg/ml（用 PH 8.0的 TAE 稀釋 10 mg/ml 母液制備而成）

紫外透射儀

步驟

1、在黑色塑料板上點(diǎn)兩排溴化乙錠 2 μl 液滴，每排六點(diǎn)。

2、取標(biāo)準(zhǔn)樣品 2 μl 與第一排溴化乙錠混勻，使各點(diǎn)的 DNA 濃度分別為 20、15、10、5、2、1（單位：ng/μl）。

3、取待測(cè)樣品經(jīng)過梯度稀釋后，各加 2 μl 于第二排的溴化乙錠上混勻。

4、把以上塑料板放到紫外投射儀的樣品臺(tái)上，關(guān)好樣品室門。以短波紫外光激發(fā)熒光，觀察每一點(diǎn)的熒光強(qiáng)度或拍照。

5、比較上下兩排的亮度，確定待測(cè)樣品的濃度。

注意事項(xiàng)

1、標(biāo)準(zhǔn)樣品含單一種類的 DNA，且大小與待測(cè)樣品相近。

2、待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品使用同樣的體積。

3、EB 具有中度毒性、強(qiáng)致癌性，操作時(shí)切記戴手套，切勿沾染到衣物、皮膚、眼晴、口鼻等。

4、沾有 EB 的用具使用完畢統(tǒng)一集中于回收容器中，經(jīng)凈化處理后方可棄。

5、該方法只能估計(jì)樣品 DNA 濃度，無法得到具體濃度，更推薦使用 Nanodrop 2000 測(cè)定 DNA 濃度。

常見問題

1. 如何選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)樣品大小？

答：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇大梯度標(biāo)準(zhǔn)樣品估計(jì)待測(cè)樣品大致大小，再縮小標(biāo)準(zhǔn)樣品梯度進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。