微生物基因組 DNA 提取實(shí)驗(yàn)

簡介

首先利用含有離液鹽的溶液裂解酵母，以確保大分子徹底變性。之后加入乙醇，裂解物離心通過微量離心管時，DNA 會結(jié)合到離心柱硅膠模上。在洗滌去除污染物后，將 DNA 用 Tris-EDTA 溶液中洗脫。回收的 DNA 可用于酶切、PCR、Southern 雜交等）。

材料與儀器

酵母基因組 DNA 提取試劑盒（試劑盒包含：Buffer GA、Buffer GB、Buffer GD、
Buffer PW、Buffer TE、Proteinase K、吸附柱 CB3、2 ml 收集管）、Lyticase、山梨醇 Buffer。

儀器：離心機(jī)

步驟

使用前先在緩沖液 GD 和漂洗液 PW 中加入無水乙醇，加入體積參照試劑盒說明即可。

1、取新鮮的酵母菌液 1.5 ml，12 000 rpm 離心 1 min，盡量吸盡上清液。

2、酵母細(xì)胞壁的破除：向菌中加入 600 μl 山梨醇 buffer，加入大約 50 U Lyticase，充分混勻。30 ℃ 靜置 30 min，4 000 rpm 離心 10 min，棄上清，收集沉淀。

3、向沉淀中加入 200 μl 緩沖液 GA 重懸沉淀，充分混勻。

4、加入 20 μl Proteinase K 溶液，吹打混勻。

5、加入 220 μl 緩沖液 GB，充分顛倒混勻，70 ℃ 放置 10 min，此時溶液應(yīng)變得澄清透亮，簡短離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

6、加 220 μl 無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心去除管蓋內(nèi)壁的水珠。

7、將上一步所得溶液以及絮狀沉淀都加入一個吸附柱 CB3 中（吸附柱放入收集管中），12 000 rpm 離心 30 sec，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中。

8、向吸附柱 CB3 中加入 500 μl 緩沖液 GD（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心 30 sec，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中。

9、向吸附柱 CB3 中加入 600 μl 漂洗液 PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12 000 rpm 離心 30 sec，倒掉廢液，將吸附柱 CB3 放入收集管中。該步驟重復(fù)操作 1 次。

10、將吸附柱 CB3 放回收集管中，12 000 rpm 離心 2 min，倒掉廢液。將吸附柱 CB3 置于室溫放置 5 分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

11、將吸附柱 CB3 轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 50~200 μl 洗脫緩沖液 TE，室溫放置 5 min，12 000 rpm 離心 2 min，將溶液收集到離心管中。

12、Nanodrop 2 000 測定基因組濃度，-20 ℃ 存儲。